纖維素酶基因的研究進展

王 偉 （廣東永順生物制藥股份有限公司 廣東 廣州 510000） 王永花 （山東省蒙陰縣科技局）

纖維素酶作為重要的糖苷水解酶，對纖維素有較好的水解作用。目前已知的天然纖維素酶已廣泛應用于各方面，但其產量難以達到生產需求，造成了大量資源的浪費。為了充分利用纖維素資源，獲得高產的纖維素酶菌株，目前國內外對纖維素酶基因工程的研究已成為熱點。本文對纖維素酶基因及其表達系統進行綜述，總結近幾年來纖維素酶基因工程的研究進展，為后續研究提供依據。

纖維素酶來源廣泛(細菌、真菌、動物體內)，其中細菌產生的纖維素酶是胞內菌且活性低，產量低，種類單一。真菌則能夠分泌大量的胞外纖維素酶，而且酶的種類齊全，其中對木霉屬、曲霉屬和青霉屬[1]研究最多。現已知的纖維素酶其基因的表達通常受多種因素的影響和制約，產量較低，難以滿足工業生產。在此基礎上人們嘗試將纖維素酶基因和高效的啟動子融合，改變纖維素酶基因的表達方式，使其異源或同源表達，顯著的提高了纖維素酶的產量，這將是提高纖維素酶生產效率的有效途徑。近幾年來分子生物學、基因工程技術發展較快，對纖維素酶分子層面的研究也在不斷深入，其中纖維素酶基因的克隆與表達成了研究的焦點。

1 纖維素酶研究進展

1.1 纖維素酶簡介

纖維素酶是由三中不同種類的酶組成的復合酶，并且各種酶之間相互協同，將纖維素最終水解為葡萄糖。纖維素酶的分類有三種：

1.1.1 內切葡聚糖酶 不同的來源名稱不同，明該類酶主要作用于纖維素分子內部的非結晶區，來自細菌的叫Cen，真菌的叫Eg。有研究表并且對CMC-NA等這種無定型纖維素的非定型區具有水解作用[2]。

1.1.2 外切葡聚糖酶 該酶又可分為β-1，4-D葡聚-葡萄糖水解酶和纖維二糖水解酶。其中β-1，4-D葡聚-葡萄糖水解酶是纖維素酶體系中的重要組成部分，對微晶纖維素和結晶度高的纖維素的水解起主導作用。

1.1.3 β-葡萄糖苷酶 它主要分解纖維二糖和纖維素糊精的非還原末端，水解葡萄糖殘基生成葡萄糖。

1.2 纖維素酶的應用

21世紀以來，我國人口數量不斷上升，畜牧業集約化水平也在不斷提高，但資源短缺的現象卻日益顯現。面對資源匱乏的嚴峻形勢，纖維素類物質卻被大量浪費：焚燒，丟棄…這些做法既污染了環境又造成了資源大量的流失。為了避免纖維素資源的浪費，目前纖維素酶已被廣泛地應用于食品、釀酒、飼料加工、紡織、洗衣、農業等多個領域中[3]。

1.2.1 食品工業的應用 將纖維素酶應用于果實和蔬菜加工過程，不僅可以避免果蔬香味和維生素的損失，而且可使植物組織軟化膨松，提高可消化性并改良口感。在油料作物加工中用纖維素酶處理法代替有機溶劑法，不僅能提高油的產量和質量，還能減少副產物的生成和降低廢物處理費用[4]。除此之外，纖維素酶還被廣泛應用于茶葉加工、食醋釀造、醬油釀造和啤酒生產等行業中。

1.2.2 飼料工業的應用 纖維素酶在畜牧業和飼料工業上也發揮著重要的作用。纖維素酶作為外源酶添加到動物日糧中，能很好的提高動物對飼料的消化率和轉化率，而且也能夠緩解目前能量飼料短缺的局面。在飼料中添加纖維素酶后，喂養效果明顯，喂蛋雞可提高產卵量，喂乳牛時，不僅體重增加，產乳量也顯著上升。程松峰等[5]在斷奶羔羊的日糧中放入纖維素復合酶，然后與未加纖維素酶的一組進行比較，結果發現加纖維素酶一組的羔羊平均日增重提高到了4.22%，料重比降低了5.2%。在肉雞的日糧中拌入纖維素酶復合物可使肉雞飼料消耗總量下降16.15%，肉雞體重增加2.78%，料肉比降低10.08%。

1.2.3 其他方面的應用 纖維素酶也廣泛的應用于造紙、洗滌、草藥提取、生態農業等方面。堿性纖維素酶作用于洗滌工業，改善了去污機制，與之前洗滌劑相比，去污能力有了很大的提高。纖維素酶也可作用于天然植物的降解，不僅節約了資源，環境也得到了很大的改善。

2 纖維素酶及其基因的研究進展

2.1 纖維素酶的研究概況

纖維素酶在19世紀就已經被發現，并且隨著技術的發展，人們在蝸牛的滑液中發現了具有分解能力的纖維素酶。纖維素酶的發展主要經過了以下幾個階段：1980年以前，主要采用傳統分離純化的方法培養產纖維素酶的微生物，并且在培養的過程中對纖維素酶有了更近一步的認識；到了八九十年代，主要研究纖維素酶基因，利用基因工程的手段對基因進行克隆與表達；近年來，在蛋白組學、宏基因組、基因組學的研究背景下，對纖維素酶分子的內部結構和功能研究較多，并且對纖維素的酶解機理有了更深入的了解。

2.1.1 國外研究 早在100多年前，Bary．A和Ward Marshall就在真菌中發現了纖維素酶。1906年，Seillicre在蝸牛的消化液中發現了有分解能力的纖維素酶。1912年，Pringsheim首次從嗜熱性纖維素細菌中分離出纖維素酶，從此揭開了纖維素酶研究的序幕。20世紀40-50年代，在對產纖維素酶微生物分離篩選的過程中，建立起較為完整的分離篩選方法。20世紀60年代后期，分離技術的發展推動了纖維素酶的分離純化工作，加快了纖維素酶的組分、作用方式及誘導作用等方面的研究進展，實現了纖維素酶制劑的工業生產。20世紀70年代，有些學者提取到了3種酶，并且發現這3種酶協同作用下可以提高纖維素酶的活性。1997年，韓國和美國學者對里氏木霉及5株溫度突變菌株產纖維素酶的條件進行研究，指出由于多種酶的協同作用，葡萄糖的產率比單獨的纖維素酶作用的總和高1.5～8倍。

2.1.2 國內研究 我國在1960年就開始了對纖維素酶的研究，隨后北京、上海等地的科研院所對纖維素酶進行了大量的研究，并且選育出一批纖維素酶菌種。1968年，北京選育出一批纖維素酶菌種。1970年，中國科學院上海植物生理研究所用誘變方法獲得了產酶能力較高的變異株。1975年，廣東省微生物研究所分離篩選出纖維素酶產生菌株—長梗木霉。20世紀90年代，在沈陽農業大學陳祖潔教授和曹淡君教授的親自指導下，黑龍江省海林市萬力達集團公司首條年產2000t纖維素酶生產線投產，實現了纖維素酶的工業化生產。

2.2 纖維素酶基因的研究現狀

（1）20世紀80年代，DNA重組技術發展迅速，并廣泛用于基因的研究，其中編碼Eng和Exg的胞外纖維素酶基因被研究較多。2009年，Rahman[6]等用T.reesei的cbh1啟動子和終止子構建表達載體來制備同源和異源性蛋白質。2011年，華南理工大學將構建的隨機整合型pWEF3基因和定點整合型pWEF32基因通過農桿菌介導轉入里氏木霉，發現pWEF31適合用于隨機性的重組試驗，而pWEF32適用于同源性重組。Anthony等[7]2012年第一次在C. biazotea中發現了GH1家族中由新型纖維二糖酶基因編碼的β-葡萄糖苷酶。（2）隨著現代科學技術的發展，獲得完整纖維素酶基因的方法也在不斷地進步。人們將細菌或真菌的纖維素酶基因放在異源菌(大腸桿菌或酵母細胞)中進行表達。李旺等[8]總結，在纖維素酶基因研究和克隆的早期，若想獲得纖維素酶基因較完整的信息，可通過構建DNA文庫和cDNA文庫的方法。而隨著技術的進步，目前可采用人工合成和選擇性的從宏基因組中擴增等方式獲得纖維素酶基因。

3 纖維素酶基因工程的研究進展

目前，雖然天然產纖維素酶的菌株有很多，但其產酶量低，產酶條件嚴苛，難以大規模的應用于生產[9]。在此基礎上，人們嘗試對基因進行克隆、異源表達來改造產纖維素酶菌株，以獲得產酶量高、活性高、易培養的工程菌[10，11]。

3.1 纖維素酶基因克隆

（1）在當今科技發展的背景下，基因的克隆技術取得了突飛猛進的進展?；蚩寺〉姆椒ㄒ延蓸嫿―NA文庫或cDNA文庫，進步為人工合成法、特異性引物擴增法，而且許多目的基因可以通過特異性引物從某一區域的宏基因組中克隆獲得。（2）到目前為止，7000多個纖維素酶基因序列及其相應的氨基酸序列被發現并記錄在Gen Bank，EMBL等共享數據庫中。同時，目前所能克隆到的纖維素酶基因都實現了異源表達。如：在畢赤酵母中成功表達了來源于枯草芽孢桿菌的纖維素酶基因；放線菌的纖維素酶基因Cel6A 和Cel6B實現了在煙草中的表達；從白蟻中克隆的纖維素酶基因在大腸桿菌中的表達等等。

3.2 纖維素酶基因原核表達系統

（1）原核表達系統是基因表達技術中發展最早，應用最廣泛的經典表達系統。與其它表達系統相比，具有目的基因表達水平高，培養周期短，抗污染能力強，成本相對低等特點。常用的原核表達系統有大腸桿菌表達系統和枯草芽孢桿菌表達系統。（2）黃艷等[12]從康氏木霉中克隆得到纖維素酶EGⅠ基因，并通過表達載體pETHis成功轉入大腸桿菌。王萬能[13]利用反轉錄PCR法，從福壽螺中克隆出纖維素酶基因CelAg，將其與載體pET-30a(+)連接并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，通過檢測得到重組菌的纖維素酶活達8.31U/ml。任慧杰等[14]將得到的松材線蟲纖維素酶編碼基因BXC46，克隆到表達載體pET-15b上，通過大腸桿菌BL21(DE3)菌株進行表達，其中部分純化的重組蛋白具有纖維素酶的活性。阮濤等[15]從綠木霉ZY－01中克隆得到了外切葡聚糖酶CBHI，并將其轉化至大腸桿菌中，成功獲得了CBHI可溶性蛋白。（3）大腸桿菌作為表達系統，水平很低，而且產生的纖維素酶大部分不能分泌到胞外，提取有很大的困難，無法達到纖維素酶生產的要求。枯草芽孢桿菌不僅在臨床等方面的應用上具有安全性，而且可以直接高效的分泌目的蛋白。李方正[16]將1株全長1518bp的枯草芽孢桿菌EG基因，通過表達質粒pMG36e-EG電轉化至乳球菌MG1614感受態細胞，成功構建了產內切纖維素酶的基因工程乳酸菌。劉暉[17]將內切葡聚糖酶基因Tv-EgVⅡ和葡萄糖苷酶基因An-BglⅠ與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體PMA5連接，并將重組質粒轉化到枯草芽孢桿菌168內，獲得了遺傳性能穩定、產纖維素酶較高的基因工程菌。

3.3 纖維素酶基因真核表達系統

（1）真核表達系統與原核表達系統相比有其優點。真核系統更容易誘導基因的高效表達，而且不會發生基因之間的非特異性激活或抑制，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。（2）木霉本身不但能合成纖維素酶，而且還能作為外源基因的表達系統，其具有成熟的發酵技術和較強的蛋白質胞外分泌能力[18]。在此基礎上，Takashima 等[19]分別從腐質霉和木霉中克隆了纖維素酶基因，并將這些纖維素酶基因轉化到米曲霉中，實現了這兩個基因在真核宿主中的高效表達，并獲得了異源纖維素酶。（3）纖維素酶基因在異源宿主表達的過程中容易遇到蛋白水解酶和糖基化等問題，這使得酵母菌成為表達的首選菌，它不僅可以使表達出的蛋白具有生物活性，而且酵母本身分泌的蛋白成分很少，利于表達蛋白的分離純化，是目前較為理想的真核表達系統;此外，酵母菌繁殖速度快、營養要求低、培養基價格低廉，更有利于工業化生產[20，21]。Zhuge等[22]成功將來源于細菌的纖維素酶基因轉化到畢赤酵母中，實現了原核細菌基因在酵母中的表達。張煜等[23]采用畢赤酵母表達系統進行了瑞氏木霉CBHⅡ基因的表達。田生禮等[24]將從嗜堿性芽孢桿菌ATCC21833中擴增得到的堿性纖維素酶基因，與酵母整合型表達載體pGAPZaA連接，并轉化至巴氏畢赤酵母GS115，成功構建了表達堿性纖維素酶的畢赤酵母工程菌。黃時海等[25]克隆了康氏木霉CBHⅠ基因，并在畢赤酵母中成功表達，檢測表達產物其酶活達到24.1U/L。（4）酵母表達系統具有將纖維素的最終分解產物—葡萄糖轉化為酒精的能力，如果能將纖維素酶系的基因克隆到酵母表達系統中，可以實現從纖維素到葡萄糖再到酒精的完整發酵過程，成為纖維素酶基因工程發展的一個重要方向。王利英等[26]反轉錄得到葡聚糖內切酶EGⅠ和EGⅢ基因cDNA，將其克隆到酵母載體中，成功構建了產生纖維素酶的釀酒酵母工程菌。

4 總結

（1）從發現纖維素酶至今，人們將注意力集中至高產酶量菌株的選育工作中，并且已取得了重要進展，但是因為選育的許多菌株產酶活性低、菌種易退化等問題使纖維素酶的工業化生產受到限制。因此，人們把注意力轉移到纖維素酶基因上，利用基因工程技術對纖維素酶基因進行克隆和異源表達，為構建高效纖維素酶分解菌等方面開辟了新途徑。（2）隨著生物及工程技術的發展，纖維素酶基因工程的發展也日新月異。為了更好地利用自然界中豐富的纖維素資源，人們對纖維素酶基因工程的研究還在繼續。相信在不遠的將來，會有更先進的技術來探索纖維素酶基因。