口蹄疫幾種新型疫苗的研究進展

劉萍董金杰（中農威特生物科技股份有限公司甘肅蘭州730046）

?

口蹄疫幾種新型疫苗的研究進展

劉萍 董金杰*（中農威特生物科技股份有限公司 甘肅 蘭州 730046）

本文就幾種有發展前途的新型口蹄疫疫苗的研究情況進行了綜述。

1 口蹄疫新型疫苗研發的必要性

（1）口蹄疫滅活疫苗自誕生以來使用70多年，實踐證明滅活疫苗可以有效地限制口蹄疫的流行范圍。與嚴格的政府防控結合時，甚至可以根除地方性口蹄疫。口蹄疫在亞洲、非洲、歐洲及美洲的許多國家都有發生，經過20世紀后半葉有效的疫苗預防接種，歐洲大多數國家和美洲部分國家都消滅了口蹄疫。目前除歐盟取消了口蹄疫滅活疫苗免疫接種政策外，南美和亞洲多數國家仍然在使用口蹄疫滅活疫苗預防和控制口蹄疫。（2）相比新型疫苗，口蹄疫滅活疫苗存在免疫效果良好、生產工藝成熟等諸多優點。但是隨著實踐經驗和研究的深入，口蹄疫滅活疫苗的缺點也逐漸被人熟知。①滅活疫苗使用以來，對滅活疫苗的未徹底滅活，造成口蹄疫的暴發；②口蹄疫滅活疫苗生產過程中存在病毒繁殖，以及對實驗動物疫苗免疫后的抗病毒攻擊試驗，這些環節稍有不慎就有可能使病毒擴散從而造成口蹄疫的流行；③口蹄疫病毒基因組非常容易變異，一旦發生變異，使用原來流行毒株制備的疫苗對變異株的保護能力就會下降。基于上述原因，研究新型疫苗勢在必行。基因工程技術的發展為新型疫苗的研發提供了思路，目前正在研發的新型疫苗有多。

2 幾種比較有潛力的新型疫苗的研究及應用情況

2.1 基因工程亞單位疫苗 （1）基因工程亞單位疫苗是指使用基因工程技術將編碼病原微生物抗原表位導入受體菌或者細胞，使其在受體中高效表達抗原，然后制備的一類疫苗。Kleid等將口蹄疫抗原基因導入大腸桿菌成功表達VP1融合蛋白抗原，并用此抗原制備了口蹄疫基因工程亞單位疫苗，在牛和豬體內均能誘導產生中和抗體，從此各國科學家開始廣泛使用這種技術研發口蹄疫疫苗。（2）1979年，有學者發現A型口蹄疫病毒空衣殼在豚鼠體內的免疫原性與完整病毒粒子相同，而抗空衣殼血清與抗病毒血清也具有相同的特異性，由此開始了空衣殼的亞單位疫苗研究。近幾年，隨著真核表達系統的發展，口蹄疫先后用酵母表達系統、昆蟲表達系統都得到較好的應用，另外，也有一些轉基因植物表達口蹄疫病毒蛋白的報道。

2.2 合成肽疫苗 合成肽疫苗是以口蹄疫病毒抗原表位的蛋白質序列為依據，用人工方法合成多肽并連到大分子載體上作為抗原，加入佐劑制備的一類疫苗。20世紀60、70年代，學者們發現口蹄疫病毒最重要的抗原決定簇位于VP1上。20世紀80年代，學者們開始嘗試使用VP1蛋白作為抗原研制疫苗，試驗證明VP1蛋白免疫具有一定效果，但還不足以保護動物受口蹄疫強毒攻擊。隨著核酸測序技術和化學合成肽技術的發展，人們逐步發現VP1上的多個重要的抗原位點，于是用化學方法合成了這些抗原位點氨基酸序列，并做了動物實驗，發現140~160肽能刺激豚鼠產生高水平中和抗體，并能保護強毒攻擊。近些年來，國內在口蹄疫合成肽疫苗的研究方面取得了很大成績，2006年，復旦大學聯合中國農業科學院蘭州獸醫研究所等4家單位共同研制的“抗豬O型口蹄疫基因工程疫苗”獲得成功，并獲得農業部頒發的“一類新獸藥證書”。中牧實業股份有限公司與上海申聯生物醫藥公司共同研發了一種將口蹄疫病毒抗原與豬IgG重鏈恒定區連接，并在大腸桿菌中高效表達的蛋白作為抗原的豬口蹄疫，免疫效果較好。隨著使用范圍的擴大，人們對合成肽疫苗的重視程度將會增加。

2.3 表位疫苗 抗原表位又叫抗原決定簇，是抗原分子中能夠與T細胞表面受體(TCR)、B細胞表面受體(BCR)或抗體分子的抗原結合片段(Fab)發生特異性結合的特殊化學基團，是引起免疫應答的物質基礎。表位疫苗是利用基因工程方法體外表達或者人工合成病原微生物的抗原表位。Bittle等合成了口蹄疫病毒O1K株VP1上的7個短肽，將其分別與KLH蛋白偶聯后免疫兔子和豚鼠，結果VP1蛋白141~160及200~213位的短肽引起機體產生較強的免疫應答，口蹄疫表位肽疫苗的研究拉開序幕。Zamorano等將口蹄疫VP1蛋白135~144、135~160短肽制成多聚體，免疫動物均能誘導機體產生高的抗體。常惠蕓、邵軍軍等利用基因技術、蛋白表達等相關技術研制了針對豬、牛和羊的口蹄疫病毒多表位重組疫苗，該疫苗無論在試驗動物還是本動物，不僅能夠誘導機體產生高水平的中和抗體，還能誘導淋巴細胞發生增殖反應，具有良好的免疫效果。曹軼梅、盧曾軍等用3個不同譜系O型口蹄疫病毒B細胞表位和通用型細胞表位串聯表達，加入聚肌胞佐劑，使免疫豬的強毒攻擊保護率明顯得到提高。

2.4 核酸疫苗 核酸疫苗也稱基因疫苗，是把外源的抗原基因克隆到質粒上，然后將此質粒轉入動物體內，是外源基因在動物內表達，產生蛋白抗原，誘導機體產生免疫反應的疫苗。從理論上講，核酸疫苗成本低，免疫期長，又易于設計和構建，因此被稱為免疫學上的第三次革命。最初構建的口蹄疫核酸疫苗包含A12株cDNA全基因組的pWRM質粒，但全基因組在表達時有可能會產生活病毒，因此在之后的研究中通常只構建表達抗原表位的核酸疫苗，而最常用表達的抗原表位仍舊是衣殼蛋白基因P1和非結構蛋白基因2A、3CD串聯起來，同時加入心肌炎病毒內部核糖體進入位點(IRES)，構建核酸疫苗，并注射到豬體內，部分豬可以抵抗口蹄疫強毒的攻擊。Shueh等為增強免疫效果將核酸疫苗和亞單位疫苗聯合使用，獲得了抗強毒攻擊的保護力。

2.5 標記疫苗 經口蹄疫滅活免疫后，動物經常出現隱形感染和持續帶毒的情況，一般認為滅活疫苗中除去絕大部分非結構蛋白，免疫動物幾乎不產生非結構蛋白抗體，而感染動物體內具有非結構蛋白抗體。因此，經常使用檢測血清中非結構抗體的方法區分免疫動物中的感染動物。新型疫苗出現后面臨與滅活疫苗同樣的問題，為了便于在實驗室區分疫苗免疫動物和感染動物，近年來出現了一些能夠進行鑒別診斷的標記疫苗。口蹄疫標記疫苗，是缺失了病毒某段致病相關基因或優勢表位基因的弱毒苗或滅活苗。利用反向遺傳操作技術，即可有目的缺失基因，構建標記病毒，同時也可修飾抗原表位基因，拓展病毒抗原譜。在研究標記疫苗的同時，也要研發相應的鑒別診斷技術，只有鑒別診斷成熟的新型疫苗才是標記疫苗。劉在新等已完成口蹄疫O型標記滅活疫苗的實驗室研究，進入臨床試驗階段。

2.6 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒是含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復制，沒有感染性，其結構與病毒相似，可以通過與病毒相同的途徑傳遞給免疫細胞，并有效地誘導機體產生免疫保護反應。隨著基因工程技術的發展，多數病毒衣殼蛋白基因都已經能夠在表達系統中有效表達并自我組裝，這為病毒樣顆粒疫苗的研發提供了便利條件。病毒樣顆粒在人用疫苗的研究非常廣泛，并已有商品疫苗投入市場，但在獸醫疫苗領域開始相關研究時間較短。孫世琪等用大腸桿菌原核表達口蹄疫VP0、VP3和嵌合型VP1在體外組裝出嵌合型FLAG外源多肽口蹄疫病毒樣顆粒，外源蛋白插入沒有影響病毒樣顆粒的空間結構，這項研究為口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的研發奠定基礎。郭慧琛等利用泛素化原核系統，研制的VLPs疫苗效力與滅活苗相當，達到了OIE和中國口蹄疫滅活疫苗的標準。周國輝等Asia1口蹄疫的Asia1/YS/CHA/05毒株的感染中能夠形成口蹄疫病毒樣顆粒，并在病毒傳代過程中穩定表達。用這種疫苗免疫小鼠，可誘導高水平中和抗體，并能持續長時間。口蹄疫病毒樣顆粒具有活病毒的很多免疫活性，但是沒有感染性，穩定性好，不易失活，因此口蹄疫病毒樣顆粒疫苗具有廣闊的發展前景。

2.7 標記疫苗 近年來，反向遺傳學技術為研究病毒基因結構與功能、病毒復制與表達調控機理等提供了有效的方法，與此同時，也為反向遺傳疫苗的研究開創了一片新天地。反向遺傳疫苗是通過反向遺傳技術實現對病毒基因的改造和修飾，獲得預期生物特性的毒株，以提高生產性能、抗原匹配性、免疫應答能力和生物安全性等特征。Fowler等將O1BF和C3RES的VP1G-H的130~157位點替換A12毒株相應位點，并制備了單價疫苗、動物實驗顯示該疫苗能夠對牛和豬等抵抗強毒攻擊。鄭海學等用反向遺傳操作技術構建疫苗種毒Re-A/WH/09株并成功研制疫苗，解決了田間毒株產量低、抗原不穩定、不適于作為種毒的難題。將Re-A/WH/09與Asia1型和O型疫苗種毒組合，研制出口蹄疫三價滅活疫苗。該疫苗對各流行毒的PD50均大于9.0，高于OIE推薦的常規疫苗3個PD50緊急免疫接種疫苗大于6個PD50的國際標準。李平花等以以O/HN/93疫苗毒株的感染性克隆為骨架，用豬毒系病毒的部分VP3和VP1基因替換疫苗毒株的相應部分，構建了嵌合的口蹄疫病毒全長cDNA克隆。該嵌合病毒的成功拯救為口蹄疫病毒嵌合疫苗的研制奠定了基礎。反向遺傳技術雖然有諸多優點，為新疫苗的研發開辟了一條新途徑，但它也存在生物安全風險，研究人員在試驗設計中應考慮如何避免毒力返強的問題。

本文介紹了近幾年研究有一定發展前景的幾種新型疫苗。新型疫苗相比滅活疫苗在安全性上更有優勢，可根據需要制備同一種病毒多個成分或多價病毒疫苗，而且大幅度降低生產成本等優點，因此新型疫苗是未來的發展方向。但新型疫苗在免疫效果方面還存在諸多問題。隨著生物工程技術的進一步發展，新型疫苗存在的問題必定得到解決。

[1] 支海兵. 口蹄疫滅活疫苗的生產現狀和產品質量分析[J]. 畜牧導刊, 2009, 6(33): 31-34.

[2] 依穎新. 豬O型口蹄疫滅活疫苗與合成肽疫苗免疫抗體群合格率比較[J]. 現代畜牧獸醫, 2012(2): 43-45.

[3] 周國輝, 王海偉, 王芳等. 口蹄疫病毒樣顆粒腺病毒表達疫苗及其免疫結果[C]. 中國微生物學術年會論文集, 2010, 79-80.

[4] Li P,Lu Z, et al. Construction of a full-length infectious cDNA clone of inter-genotypic chimeric foot-and-mouth disease virus[J]. wei sheng wu xue bao, 2012, 52(1): 114-119.

[5] Shao J, Wang J, Gao S, et al. Potence of a novel multi-epitope vaccine against foot-and-mouth disease in guinea pigs[J]. Virologica Sinica, 2014, 30(7): 692-697.

[6] Segundo F D, Weiss M, Perez-martin E, et al. Incoculation of swine with foot-and-mouth disease SAP-mutant virus induces early protection against disease[J]. J Virol, 2012, 86(3): 1316-1327.

[7] Zheng H, Guo J, Jin Y, et al. Engineering Foot-and-mouth Disease Viruses with Improved Growth Properties for vaccine development[J]. PLoS ONE, 2013, 8(1): e55228.

（2018–07–09）

S852.4+2

A

1007-1733(2019)01-0079-02