Fstl1-TGF-β1-Smad2/3信號通路與肺纖維化的靶向治療

楊 華，張莉莉

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是以上皮細胞受損、成纖維細胞增殖活化、細胞外基質聚積、肺泡不可逆性破壞為主要特點的肺間質性疾?。╥nterstitial lung diseases，ILDs）， 是多種間質性肺病的終末期改變。在纖維化肺疾病中，繼發于結締組織病的肺纖維化 （connective tissue diseaseassociated interstitial disease，CTD-ILD） 常常以組織病理學的不同類型為特征，不同的病理類型對藥物的反應不一，而特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是臨床較為常見的疾病，病因未明，具有漸進性和致死性。兩類肺纖維化具有異質性，又有共同的致纖維化途徑［1］。肺纖維化常見癥狀有咳嗽、進行性呼吸困難、乏力等，晚期多因呼吸衰竭而死亡，半數可伴杵狀指和發紺。由于肺纖維化預后差，致殘率和致死率高，藥物療效有限，嚴重威脅患者的生活質量和生存率，成為近年來診治的難點而備受關注。

目前IPF病因和發病機制都不很清楚，可能與環境（如接觸金屬和木粉）、吸煙、藥物、遺傳、病毒感染等因素相關。新近一項研究報告顯示，美國IPF 的患病率是（14.0～42.7）/10 萬人口［2］，但我國缺乏相應的流行病學數據，中華醫學會呼吸病學分會根據國內十幾家綜合醫院就診資料發現，近10年我國住院的IPF患者的比例呈明顯的上升趨勢。由于IPF預后較差，發病率及病死率呈逐年增加的趨勢，根據歐洲10個國家統計機構提供的1999年—2012年間的IPF死亡率，年齡標準化死亡率為4～10/10萬人口，且與年齡呈正相關，男性多發［3］。IPF久治不愈的主要原因是對IPF發病機制缺乏正確的認識，因而缺少特異性的高效治療藥物及措施。早先免疫抑制劑被認為是IPF的重要治療手段，糖皮質激素聯合硫唑嘌呤或環磷酰胺甚至效果更優，但2015年更新的ATS/ERS/JRS/ALAT臨床實踐指南明確不推薦強的松+硫唑嘌呤+N-乙酰半胱氨酸，同時不推薦使用的還有抗凝劑華法林、選擇性內皮素受體拮抗劑安倍生坦、單靶位酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼，有條件地推薦使用多靶位酪氨酸激酶抑制劑尼達尼布、吡菲尼酮、抗酸治療［4］。氧療只是一種對癥的手段，不能從根本上治愈肺纖維化；而肺移植在我國面臨供體稀缺的問題，能接受肺移植的患者極少；目前臨床各種藥物只是延緩肺纖維化的進程，并不能阻止或逆轉肺纖維化的發展。

近年來，隨著對肺纖維化發病機制的深入研究，發現細胞因子在疾病發生發展的過程中起到非常關鍵的作用，其中轉化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）信號傳導通路與肺纖維化關系密切，基于此，為尋求治療的新途徑，國內外學者進行了以其為靶點的實驗性肺纖維化治療研究。該文就肺纖維化中TGF-β信號傳導通路及其靶向治療做一綜述。

1 TGF-β家族及影響肺纖維化的信號通路

TGF-β超家族是包含多種多肽類生長因子的家族，主要有TGF-β、骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMP）、激活素、抑制素、穆勒氏管抑制物質（Mullerian inhibitor substance，MIS）、生長分化因子等，參與細胞生長、胚胎發育、組織修復、成骨分化、細胞外基質沉積等。TGF-β超家族成員有以下共同特征：（1）N-末端有1段信號肽序列，可借以跨過內質網；（2）緊靠生物活性區有由4個氨基酸殘基（RSRR）組成的蛋白酶加工位點；（3）C-末端包含 9個保守的半胱氨酸的生物活性區，靠分子間的二硫鍵形成二聚體。

業已證實，纖維增生的病理基礎是成纖維細胞活化和廣泛的基質重塑。促纖維化因子刺激成纖維細胞過度表達纖維化基質蛋白，促使更多的促纖維化細胞因子表達。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）可以預示成纖維細胞活性，體外實驗發現肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，肺泡上皮細胞）通過TGF-β介導的間充質轉化能通過CTGF的產生激活肺成纖維細胞（lung fibroblast，LF）［5］。在哺乳動物體內 TGF-β 有 3 種亞型，TGF-β1 和 TGF-β2 促進瘢痕組織形成，而TGF-β3有抗瘢痕形成的作用。TGF-β1是一個多功能的細胞因子，參與調控發病機制方面是非常明確的，在肺纖維化發病過程中起著中樞調控的重要作用，是作用最強的致纖維化因子。TGF-β1在組織損傷修復過程主要通過誘導下游經典的Smads（drosophila mothers against decapentaplegic protein）蛋白信號通路和非經典的Smads信號通路，參與肺泡上皮細胞的增殖、凋亡、自噬，誘導成纖維細胞的分化，促進肌成纖維細胞（myofibroblast，MF）的增殖、遷移、侵襲，并維持成纖維細胞持久生存，促進細胞外基質的合成，在IPF發生發展的各個階段起著主要的促進作用［6］。

2 以 Fstl1-TGF-β1-Smad2/3信號通路為靶位點的抗纖維化治療

2.1 以Fstl1為靶位點的抗纖維化治療卵泡抑素樣蛋白 1（follistatin-like 1，Fstl1）是一種細胞外的分泌型糖蛋白，富含半胱氨酸，隸屬酸性分泌蛋白家族，具有多種生物學功能，參與調控細胞增殖、凋亡、分化、代謝等多種病理生理過程，并通過激活多種信號通路發揮作用。TGF-β1在轉錄和翻譯水平調控Fstl1表達，有研究表明鼠肺成纖維細胞TGF-β1調控 Fstl1表達上調，TGF-β1-Smad3-c-jun通路在這一過程中起到至關重要的作用［7］。Fstl1可以通過促進TGF-β1/Smad2/3信號通路來調控成纖維細胞的活化和細胞外基質的合成，上調細胞外基質表達，具有促纖維化作用［8］。Fstl1的缺失對小鼠的肺臟發育及氣管重塑等方面都有不同程度的影響［9，10］。有研究者通過動物體內實驗充分證實了使用Fstl1中和抗體能減少小鼠肺纖維化的發展［8］。葛根素提取物能改善百草枯所致的肺纖維化，研究發現葛根素提取物主要是通過抑制微小RNA-21（miR-21）的表達拮抗 Fstl1通路和氧化應激反應，抑制炎癥和成纖維細胞增殖，達到減輕肺纖維化的目的［11］。大量研究表明，Fstl1在肺纖維化、炎癥、代謝等方面起著重要的作用，隨著蛋白組學在臨床上的深入研究，Fstl1的功能及其作用機制將會進一步明確，具有潛在的靶向治療前景。

2.2 以TGF-β1為靶位點的抗纖維化治療

2.2.1 相關的治療藥物 首先吡非尼酮已被證明是細胞因子和生長因子的調節劑，抑制TGF-β1、血小板衍化生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達，抑制腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-18（IL-18）的產生，減少成纖維細胞增殖分化，減少膠原纖維合成和細胞外基質沉積［12］。吡菲尼酮無論在臨床試驗還是現實治療中具有良好的安全性，被FDA認定為是突破性治療肺纖維化的藥物。有學者統計了自1995年以來收錄于Pubmed數據庫中有關吡菲尼酮治療IPF的相關文獻，IPF中位生存期2.8～4.2年，5年生存率為20%，吡菲尼酮有良好的耐受性，可以延緩用力肺活量 （forced vital capacity，FVC）下降，增加6分鐘步行試驗距離、延長無進展生存期 （progression-free survial，PFS）、降低死亡率。然而為了達到能夠耐受長期用藥以從中獲益的目標，加強藥物不良反應的監管至關重要，主要治療相關不良事件有胃腸道不適、皮疹和光敏性。為減少藥物對胃腸道的刺激，結合藥代動力學特點，該藥宜在進餐時服用［13，14］。新近有報道采取吡菲尼酮吸入或肺內給藥的方式治療百草枯誘導的肺纖維化模型鼠，通過比較形態學、羥脯氨酸含量、TGF-β1、TNF-α、基質金屬蛋白酶組織抑制劑 1（TIMP-1）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）等指標的變化與口服給藥對比，發現兩者療效相似但吸入給藥用劑量少、不良反應少，認為吸入給藥具有很大的潛力［15］。中藥川芎嗪不僅可以改善肺臟血液循環，還可以對抗脂質過氧化反應，我國學者對博來霉素誘導的肺纖維化大鼠模型應用丹參聯合川芎嗪腹腔注射，發現可下調大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1的表達水平，減輕肺泡炎癥和肺組織纖維化的進程［16］。再者，如它與血管內皮功能關系密切，促進內皮細胞增殖、遷移、維持血管通透性、促組織纖維化等方面發揮作用，與TGF-β、成纖維細胞生長因子 （fibroblast growth factor，FGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等共同參與氣道重塑。血管改變是氣道重塑的特征之一，研究表明，以布地奈德預處理成纖維細胞可抑制磷酸化Smad3水平，降低TGF-β1表達及其誘導的VEGF產生，抑制細胞外基質合成［17］。霧化吸入局部用藥作用直接，不良反應小，有望成為臨床抗肺纖維化治療的新選擇。維生素D能抑制肺超微結構病變，顯著減少肺組織內細胞基底膜的厚度，降低羥脯氨酸水平，下調TGF-β1的表達，從而抑制成纖維細胞增殖活化，有效地減輕肺纖維化的進程［18］。

2.2.2 通過基因技術及細胞分子技術的治療 該兩項技術可干預TGF-β1信號通路的傳導，有益于肺纖維化的治療。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NDAPH氧化酶，NOX）是機體組織氧化應激的酶類，其亞型NOX4在肺泡上皮細胞、肌成纖維細胞、內皮細胞、氣道平滑肌細胞均有表達，產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與調控細胞增殖、分化、凋亡，促成肺纖維化的發生。NOX4抑制劑減弱TGF-β1介導的促纖維化基因上調，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，減少細胞外基質沉積，是抗肺纖維化治療中很有前景的靶點［19］。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有強大的自我復制更新能力，有多向分化潛能，具有免疫調節功能和低免疫原性，加上肺組織高容量低阻力的結構特性，使得MSC易于肺內沉積，在呼吸系統疾病中應用廣泛?？上抡{MMP-9、TIMP-1、INF-γ、TGF-β1，減輕肺泡炎，促進細胞外基質的降解，減輕肺纖維化［20］。 Srour等［21］回顧分析了 17 項有關MSC治療博來霉素誘導的動物肺纖維化模型的報告，發現MSC主要在初始炎癥階段而非纖維化階段發揮療效，能夠改善肺纖維化的膠原沉積和Ashcroft病理評分。

2.3 以Smads蛋白為靶分子的抗纖維化治療Smads蛋白的表達調控在肺纖維化發病機制中起重要作用，Smad3通路抑制劑或提高Smad7的表達以阻斷TGF-β1信號轉導途徑，可能為纖維化疾病的治療提供一種新手段。

Smad3是主要的TGF-β1/Smads信號通路活化蛋白，Smad3蛋白的正常表達是形成肺纖維化所必需的。成纖維生長因子受體抑制劑ponatinib是一種多靶點激酶抑制劑，主要用于治療白細胞。但研究表明ponatinib通過抑制TGF-β1/Smad3通路，抑制TGF-β1介導的上皮間充質轉化（EMT）和Ⅰ型肺泡上皮（AT1）凋亡，抑制成纖維細胞增殖，延緩肺纖維化進程，拓寬了 ponatinib的治療領域［22］。 miRNA 的表達與IPF密切相關。博來霉素誘導的上皮間質轉化有利于胸膜間皮細胞遷移和胸膜下肺纖維化，而胸膜下肺纖維化是博來霉素肺纖維化模型鼠的病理標志，研究發現纖維化模型鼠肺mir-18a-5p表達減少，而mir-18a-5p已被確定與TGF-β受體Ⅱ的mRNA的3UTR區結合，抑制TGF-β1-Smad2/3通路，因此mir-18a-5p過度表達可抑制TGF-β1介導的胸膜下肺纖維化，為IPF的治療提供新途徑［23］。紫杉醇是臨床上應用廣泛的抗腫瘤藥物，研究發現低劑量紫杉醇通過下調mir-140抑制TGF-β1/Smad3通路，mir-140增加可導致肺泡上皮細胞的上皮間質轉化，紫杉醇對此有表型逆轉作用，減少膠原沉積，從而發揮抗纖維化的作用［24］。因此Smad3是很有前景的抗纖維化治療靶點。另一項實驗研究表明白介素-27（IL-27）是兼有促炎和抗炎作用的多功能細胞因子，可增加上皮細胞表型標志物表達，抑制TGF-β1誘導的上皮間充質轉化，抑制TGF-β1/Smad通路相關蛋白的磷酸化。以Smad3特異性抑制劑SIS3對細胞預處理后，IL-27抑制上皮間充質轉化的作用顯著增強，從而減輕肺纖維化［25］。傳統中藥青蒿素除抗瘧作用外，還具有抑制生長因子表達、抗炎及免疫調節作用，研究發現雙氫青蒿素抑制 TGF-β1、smad2、smad3基因和蛋白表達，通過抑制TGF-β1-Smad2/3通路減輕組織炎癥和纖維化程度［26］。

Smad7是TGF-β1/Smads的信號通路最主要的負調蛋白，Smad 7蛋白的上調可以抑制肺纖維化的進程。動物實驗發現組蛋白去乙?；敢种苿┬炼１桨樊惲u肟酸（SAHA）通過穩定Smad7水平，防止Smad去乙酰化，降低Smad3活性，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化和膠原表達，抑制TGF-β1誘導的組蛋白去乙酰化酶活性，起到抗肺纖維化作用［27］。另有研究表明甲基轉移酶set9可通過上調Smad7蛋白水平抑制TGF-β1介導的細胞外基質沉積和膠原產生，提出蛋白甲基轉移酶可作為肺纖維化的治療靶點的可能性［28］。肺間充質干細胞（lung resident mesenchymal stem cells，LR-MSC）成肌纖維細胞分化在IPF中起重要作用。通過比較miRNAS在LR-MSC成肌纖維細胞分化前后的表達譜，發現mir-877-3p是纖維化相關miRNA，mir-877-3p螯合劑通過smad7通路抑制LR-MSC成肌纖維細胞分化，減輕肺纖維化，提示mir-877-3p具有治療肺纖維化的潛力，值得深入研究［29］。HasmiR-326調節TGF-β的表達，其水平與人類多種細胞TGF-β蛋白水平呈負相關，人IPF肺標本與非纖維化肺相比，miR-326表達顯著減少，在博來霉素誘導的肺纖維化模型鼠TGF-β表達增加與mmu-miR-326相關，miR-326鼻腔給藥可以下調轉錄因子 Ets1、Smad3和 MMP-9，上調Smad7，抑制TGF-β的表達，認為miR-326有助于開發研制肺纖維化的治療新策略［30］。

綜上所述，雖然TGF-β1信號轉導通路抑制劑在體內和體外實驗中雖然均被證實對抗肺纖維化治療有效，但用于臨床之前，仍需要進行更加深入的研究，以確保治療的安全有效性。TGF-β1信號的轉導與調控是一個涉及多通路多靶點的復雜過程，進一步探明TGF-β1信號傳導通路對于發現肺纖維化的有效治療靶點、開發更有效的治療藥物及治療技術、控制肺纖維化具有重要意義。