沃替西汀氫溴酸鹽抑制腸道菌群

束慧

摘 要-葡萄糖醛酸苷酶（GUSB）是一類重要的存在于腸道菌群代謝物中的酸性水解酶，可催化分解具有 -葡萄糖醛酸苷結構的底物。腸道菌群產生的GUSB可影響多種藥物的藥代動力學行為，例如，伊立替康等藥物的葡萄糖醛酸化產物可被腸道菌群產生的GUSB分解成為苷元并在腸道局部累積，可能引發嚴重的胃腸不良反應。因此，尋找或開發高效抑制腸道菌群產生的GUSB活性的藥物，對于緩解一些臨床藥物產生的副作用而引發的嚴重腹瀉具有重要意義。在本課題中，我們發現沃替西汀氫溴酸鹽可以高效地抑制GUSB活性。

關鍵詞 沃替西汀氫溴酸鹽-葡萄糖醛酸苷酶 抑制劑 腸道菌群

中圖分類號：R914文獻標識碼：A

近年來，腸道菌群與多種疾病研究已成研究的熱點。近些年來一些研究成果表明，腸道菌群與多種神經系統疾病的發生、藥物的吸收及代謝過程密切相關。 -葡萄糖醛酸苷酶（ -glucuronidase，GUSB），編號EC3.1.1.31，是溶酶體內的酸性水解酶，可催化 -D-1，4-葡萄糖醛酸苷糖苷鍵發生水解，釋放出 -葡萄糖醛酸和相應的配基。

人源GUSB的蛋白質結構與大腸埃希菌（E. coli）的GUSB蛋白質晶體結構先后被解析出來。1996年Jain等人首次解析了人源GUSB的蛋白質晶體結構，2010年Wallace等人對大腸埃希菌的GUSB蛋白質晶體結構完成的解析。大腸埃希菌GUSB蛋白質結構由2種不同的亞基組成，每個亞基含597個氨基酸殘基，相對分子質量均約為70 KD;N端由180個氨基酸殘基組成，C端的折疊由274-603氨基酸殘基夠成;催化活性結合位點為Glu 413和504，相鄰亞基之間的菌環結構（bacterial loops）。大腸埃希菌產生的GUSB與人源GUSB的氨基酸序列相似度約為45%，大腸埃希菌GUSB蛋白結構中具有菌環結構，但是人源GUSB無此結構。因此，可以根據大腸埃希菌GUSB中的菌環結構設計出特異性抑制劑。目前常見的GUSB活性檢測方法主要有以下3種：比色分析法、熒光法和高效液相色譜法。本研究使用比色分析法對大腸埃希菌 GUSB進行活性檢測。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

沃替西汀氫溴酸鹽（美國Selleck公司， S8021）; -葡萄糖醛酸酶（美國Sigma公司，G7646-5KU ） ;4-硝基苯基 -D-葡糖苷酸（美國Sigma公司，73677-250MG ）;4-硝基苯酚（美國Sigma公司，1048-5G）;大腸埃希菌（實驗保存）;細菌用蛋白酶抑制劑復合物 （生工，C500027-0001）;磷酸鹽緩沖液（pH7.4）;糞便蛋白提取液;超聲破碎儀（賽飛公司，Biosafer 650-92）;水浴鍋（其林貝爾）;酶標儀（美國Thermo公司，Mlutiskan FC）。

1.2-葡萄糖醛酸苷酶活性分析

1.2.1-葡萄糖醛酸苷酶純酶活性檢測

將 -葡萄糖醛酸苷酶純酶粉末配制成5U/ul溶液，取33ul加入到1.617 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）中混合均勻，加入到96孔板的33孔中。使用PBS將沃替西汀氫溴酸鹽配制成以下濃度：30，10，3.33，1.11，0.37，0.123，0.041，0.0137，0.0046，0.0015 uM，各取100ul加入到含有 -葡萄糖醛酸苷酶的96孔板中，每個濃度做3個復孔。每孔加入2ul（25mM）反應底物4-硝基苯基 -D-葡糖苷酸（PNPG），37℃避光反應1小時。使用1xPBS將4-硝基苯酚（PNP）稀釋成濃度分別為1，5，10，20，40，80，100和200uM的標準溶液，各取100ul上述標準液，各加入150ul 0.2M Na2CO3，混勻1min，405nm測定其吸光度，得到標準曲線方程式，依次計算出對硝基酚法所測得的每毫升反應液中所含對硝基酚的含有量。

1.2.2大腸埃希菌中 -葡萄糖醛酸苷酶純酶活性檢測

將1ul大腸埃希菌菌液使用9ul滅菌的PBS稀釋后，涂布于無抗性LB固體培養基，倒置在37℃過夜培養。挑取2個克隆分別加入含有5ml LB液體培養基的50ml離心管中，置于37℃搖床，200rpm孵育過夜。4000rpm離心5min，棄LB液體培養基，加入10ml預冷的PBS洗滌兩次，離心棄PBS，再次加入2ml預冷的PBS（含20ul 細菌用蛋白酶抑制劑復合物），超聲破碎至液體變澄清，12000rpm離心30min，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒，檢測蛋白濃度。取3ul（1.61ug/ul）裂解產物檢測其中 -葡萄糖醛酸苷酶的活性，加入不同濃度的沃替西汀氫溴酸鹽。沃替西汀氫溴酸鹽濃度及相關步驟參照1.3.1。

1.3統計學分析

實驗數據錄入Prism 5.0 （GraphPad Software）統計軟件進行分析，數據用均數 ？標準差 （ x ？s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0. 05為差異有統計學意義。

2結果

2.1?-葡萄糖醛酸苷酶純酶活性檢測

以對硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）作為標準品，繪制標準曲線，得出 y = 0.0042x + 0.0612，R2 = 0.9964（圖1-A）。根據所得到的OD值，計算出IC50=0.2212 uM（圖1-B）。高濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的 -葡萄糖醛酸苷酶純酶活性，相比于PBS組下降明顯;低濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的 -葡萄糖醛酸苷酶純酶活性，相比于PBS組沒有顯著性差異（圖1-C）。

圖1（A）PNP作為標準品得到的標準曲線，y = 0.0042x + 0.0612，R2 = 0.9964;（B）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與5U GUSB及2ul（25mM）PNPG反應，計算得到IC50=0.2212 uM;（C）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與2ul（25mM）PNPG反應所得OD值的統計學結果顯示，0.0137，0.0046和0.0015 uM組分別與對照組相比沒有統計學意義，30，10，3.33，1.11，0.37，0.123和0.041uM組分別與對照組相比有統計學意義，p<0.001。

2.2沃替西汀氫溴酸鹽對E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性的影響

以對硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）作為標準品，繪制標準曲線，得出 y = 0.0043x + 0.0698，R2 = 0.9937（圖2-A）。根據所得到的OD值，計算出IC50=0.9043 uM（圖2-B）。高濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性，相比于PBS組下降明顯，有顯著性差異（ P<0. 01）;低濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性，相比于PBS組沒有顯著性差異（圖2-C）。

圖2（A）PNP作為標準品得到的標準曲線，y = 0.0043x + 0.0698，R2 = 0.9937;（B）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與3ul（1.61ug/ul）E. coli裂解產物及2ul（25mM）PNPG反應，計算得到IC50=0.9043 uM;（C）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與3ul（1.61ug/ul）E. coli裂解產物及2ul（25mM）PNPG反應所得OD值的統計學結果顯示，1.11，0.37，0.123，0.041，0.0137，0.0046和0.0015 uM組分別與對照組相比沒有統計學意義，30，10，3.33和1.11uM組分別與對照組相比有統計學意義，p<0.001。

3討論

腸道菌群和多種疾病的產生有著密切的相關性，已成為多種疾病治療靶點。腸道菌群產生的GUSB可催化諸多藥物發生水解，釋放的苷元會引起嚴重的遲發型腹瀉，沃替西汀氫溴酸鹽通過抑制GUSB活性，減少相關藥物的葡萄糖醛酸苷產物發生水解，確保腸道菌群的種類及數量的平行，達到治療遲發型腹瀉的效果。近年來，隨著對藥物研究的不斷深入，新藥的開發成本太高、周期太長，新藥老用已成為研究的熱點。我們還可以從一線臨床用藥、中草、食品或土壤成分尋找腸道菌群中GUSB的特異性抑制劑，結合高效安全的生物學和化學衍生技術獲得更加安全高效的腸道菌群中GUSB活性抑制劑。

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