PPAR受體色譜模型的構(gòu)建及在小分子肽篩選中的應(yīng)用研究

侯亞妮 王輝 劉榮利

摘??????要：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）在核激素受體中起著非常重要的作用。PPRA有許多亞型，其γ亞型（PPARγ）是控制內(nèi)分泌代謝的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法論證了PPAR受體在小分子肽篩選中的作用。選擇人參總皂苷、人參皂苷和大黃提取物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以驗(yàn)證不同篩選方法的可行性。使用人參總皂苷和大黃提取物在自制的生物柱上分析實(shí)驗(yàn)中的試劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總?cè)藚⒃碥蘸痛簏S提取物具有作用于PPARγ的成分。

關(guān)??鍵??詞：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體;生物色譜法;人參總皂苷;大黃提取液

中圖分類(lèi)號(hào)：O?657.7⁺2 ???????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A ??????文章編號(hào)：?1671-0460（2019）11-2481-04

Construction of PPAR Receptor Chromatography Model and

Its Application in Screening of Small Molecule Peptides

HOU Ya-ni， WANG Hui，?LIU Rong-li

（School of Medicine， Xian Peihua University， Shaanxi Xian 710025， China）

Abstract： Peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR） is a very important member of the medical community and plays a very important role in nuclear hormone receptors. There are many subtypes of PPRA， and its gamma subtype （PPARγ） is a key factor in controlling endocrine metabolism. In this paper， the role of PPAR receptors in the screening of small peptides was demonstrated by experimental methods. The ginseng total saponins， ginsenosides and rhubarb extracts were selected as experimental subjects to verify the feasibility of different screening methods. The reagents in the experiments herein were analyzed on a homemade biocolum using ginseng total saponins and rhubarb extracts. The experimental results showed that the total ginsenoside and rhubarb extract had components acting on PPARγ

Key words： Peroxisome proliferator-activated receptor; Biochromatography; Ginseng total saponins; Rhubarb extracts

眾所周知，受體是人體內(nèi)一類(lèi)重要的蛋白質(zhì)，參與體內(nèi)的許多生理生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)生理功能，且是許多藥物的作用靶點(diǎn)^[1，2]。在目前上市的藥物中，許多藥物均是作用于PPARγ受體而發(fā)揮療效的，所以PPARγ受體是生命科學(xué)與藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。受體生物色譜是將試劑均勻地分布在色譜的相表面，其用于試劑與受體之間的互相作用，從而可以得到試劑在各個(gè)不同點(diǎn)位的作用強(qiáng)度等特點(diǎn)，同時(shí)利用受體與試劑的這種特性可以建立一種高效、迅速、穩(wěn)定的篩選方法^[3]。

1 ?PPAR受體

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）^[4-6]在醫(yī)學(xué)研究中起著非常重要的作用。它在核激素受體中起著非常重要的作用^[7]。在治療各種疾病中可以作為潛在的靶點(diǎn)發(fā)揮作用，同時(shí)其對(duì)于一些比較難治的疾病起到了調(diào)節(jié)的作用。

國(guó)內(nèi)外基于應(yīng)用組合化學(xué)肽庫(kù)技術(shù)篩選小分子肽都有過(guò)很多介紹^[8，9]。龐秀枰等^[10]使用“一個(gè)珠子和一個(gè)肽鏈”的化學(xué)肽文庫(kù)技術(shù)的組合，通過(guò)對(duì)肺癌細(xì)胞的研究挑選出了我們現(xiàn)在使用比較廣泛的氨基酸庫(kù)。并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到了與肺癌細(xì)胞緊密聯(lián)系的小分子肽結(jié)構(gòu)。此外，許芳等^[11]以不同形式的生物素作為樣本標(biāo)記小分子肽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小分子肽能夠作為很好的識(shí)別體去反應(yīng)肺癌細(xì)胞的臨床效果。

2 ?PPAR受體色譜模型的構(gòu)建

2.1 ?生物色譜法

PPARγ色譜法的原理是通過(guò)一個(gè)特定的受體固定在載體上，然后用我們常用的分析方法挑選出試劑。通過(guò)待篩選的試劑在靜止期的行為去推斷試劑與PPARγ是否結(jié)合。與上述方法相比，生物色譜法不需要純度更高的單體，篩分活性成分更簡(jiǎn)單，更快速，更可重復(fù)。

生物色譜法中，最重要的是選擇一個(gè)合適的材料。在眾多材料中首選硅膠，因?yàn)楣枘z作為實(shí)驗(yàn)材料，它能表現(xiàn)出很好的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)，它的表面積相對(duì)其他實(shí)驗(yàn)材料來(lái)說(shuō)也更大。不過(guò)硅膠表明的極性基團(tuán)對(duì)于受體的活性會(huì)產(chǎn)生一定的影響。為了解決這一問(wèn)題，劉嘉君等^[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析提出了細(xì)胞膜的色譜法。細(xì)胞膜色譜法和生物色譜法類(lèi)似，都是通過(guò)一個(gè)特定的受體固定在載體上，只是細(xì)胞膜的載體換成了硅膠。兩者都能確定我們?cè)囼?yàn)所使用的載體和細(xì)胞膜的受體之間的關(guān)系。

2.2 ?受體色譜的特點(diǎn)

受體色譜結(jié)合了受體和色譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，故其具有高靈敏度、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)。現(xiàn)今醫(yī)學(xué)研究中，已有很多學(xué)者將藥物與受體之間的特異性的能力作為篩選試劑的有效方法^[13]。受體色譜的概念結(jié)合了受體和色譜之間的特性，有效地?cái)U(kuò)展了色譜的研究范圍，使人們能夠更加清楚地了解色譜的特性。

受體色譜與以往的色譜技術(shù)相比，存在以下的優(yōu)勢(shì)：首先，受體色譜是通過(guò)特定的方式固定載體，能夠很好地確保實(shí)驗(yàn)試劑的效果;其次，受體色譜的載體—硅膠具有很多的穩(wěn)定性能，能夠重復(fù)利用，易于出現(xiàn)理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;最后，色譜方法可用于梳理、調(diào)節(jié)和優(yōu)化固定受體的構(gòu)象和方向，以最大化體內(nèi)受體-藥物的相互作用。可用于中藥復(fù)雜系統(tǒng)中藥物-受體相互作用的高效、靶向篩選和快速分析。本文建立了系列受體色譜模型（圖1）。

3 ?PPAR受體色譜模型的應(yīng)用

PPAR作為很多疾病的靶向細(xì)胞有著得天獨(dú)厚的效果。從目前人們研制出來(lái)的各個(gè)治療糖尿病的藥品來(lái)看，大部分都具有一定的毒副作用，現(xiàn)在急需一種能夠安全、有效的針對(duì)糖尿病的PPARγ制劑。在我國(guó)中醫(yī)已成為一種重要的方式來(lái)緩解人們的疾病。由于中醫(yī)大都選用的是純天然的草藥，其毒副作用很小，現(xiàn)在市面上出售的很多治療糖尿病的天然藥物都參考了中醫(yī)的特性。但是，由于其中很多都沒(méi)有經(jīng)過(guò)特定的實(shí)驗(yàn)，并且實(shí)驗(yàn)人員的素質(zhì)參差不起，缺乏藥理知識(shí)，導(dǎo)致真正發(fā)揮天然草藥的藥品還很少。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷、梔子、大黃等都可以作為治療糖尿病的優(yōu)選中藥，但是這些中草藥怎么發(fā)揮其藥效的還沒(méi)有得到很好的驗(yàn)證。

3.1 ?實(shí)驗(yàn)儀器

本節(jié)所用儀器如表1所示。

3.2 ?實(shí)驗(yàn)試劑

本節(jié)所用試劑如表?2所示。

3.3 ?實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，制備人參總皂苷溶液，注射體積為12 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm。流速為0.25 mL/ min，色譜柱的設(shè)計(jì)溫度為25 °C，流動(dòng)相為乙腈-水（18/90，V/ V），連續(xù)實(shí)驗(yàn)3次。觀察總?cè)藚⒃碥赵谧灾粕镏系慕Y(jié)果。

收集自制生物柱上的人參總皂苷的保留組分并通過(guò)HPLC-MS分析。本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式，源極的注入電壓為-4.6 kV，離子源溫度為280 ℃，霧化氣體為N₂。碰撞氣體為Ar，注入體積為12 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm，流速為0.3 mL /min，柱溫為25 ℃。?流動(dòng)相為甲醇-水（80/20，V/V）。

稱(chēng)取0.2 g粉狀榛子粉（100目篩），放置與提前準(zhǔn)備好的消毒燒杯中，用適量?57%的甲醇提取?15 min，取出實(shí)驗(yàn)后的溶液靜置，待15 min之后冷卻至室內(nèi)的溫度。

以12 μL的注射體積，230 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)和0.2 mL/min的流速注射榛子提取物溶液。柱的設(shè)計(jì)溫度為25 ℃，流動(dòng)相為T(mén)ris-EDTA-MgCl₂。

3.4 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

自制生物柱上人參總皂苷的色譜圖如圖2所示。色譜圖是方框中的部分。通過(guò)圖2可以看出：人參皂苷中有一定的活性成分與受體PPAR 相關(guān)。保留的成分將通過(guò)HPLC-MS進(jìn)行分析。

通過(guò)對(duì)總?cè)藚⒃碥者M(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析可以發(fā)現(xiàn)：Re?的總離子流圖與總?cè)藚⒃碥盏谋Ａ舫煞只疽恢拢ㄈ鐖D3所示）。

通過(guò)對(duì)大黃的實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：大黃的提取液在色譜柱上有著很明顯的區(qū)別。大黃在PPARγ柱有著正常的表現(xiàn)，但是其在負(fù)柱上基本沒(méi)有成本留下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)中注入大黃的提取液，其會(huì)產(chǎn)生一種成分作用于試劑上，與PPARγ類(lèi)似（如圖4所示）。PPARγ生物色譜柱的穩(wěn)定性如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生物色譜柱對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑的保留性逐漸減小。

4 ?PPAR受體的小分子肽篩選

目前，有兩種常用的篩選小分子肽的方法：?一種是“一個(gè)珠子和一個(gè)肽鏈”的組合化學(xué)肽庫(kù)，另一個(gè)是噬菌體展示肽庫(kù)方法。

1991年，林教授首次提出了“一珠一肽鏈”的化學(xué)肽庫(kù)技術(shù)，“建立”原則是在樹(shù)脂珠上隨機(jī)合成天然和非天然氨基酸，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可以合成不同長(zhǎng)度和構(gòu)象（環(huán)狀或線性）的肽鏈，例如4、6和8個(gè)氨基酸。每個(gè)珠子上只有一條肽鏈，通過(guò)這種篩選方法可以篩選出實(shí)驗(yàn)所需的樣本，并且篩選出來(lái)的樣本的成功率極高。除了組合化學(xué)肽方法，實(shí)驗(yàn)中還可以用到噬菌體展示方法。由于噬菌體在篩選蛋白質(zhì)的過(guò)程中不能保證篩選出來(lái)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，故對(duì)于篩選小分子肽人們普遍選用組合化學(xué)肽方法。

5 ?結(jié)束語(yǔ)

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法論證了PPAR受體在小分子肽篩選中的作用。實(shí)驗(yàn)選取了人參總皂苷、人參皂苷、大黃提取液作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，驗(yàn)證了不同的篩選方式的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總?cè)藚⒃碥蘸痛簏S提取物具有作用于PPARγ的成分。

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