玫煙色棒束孢Pr1酶活力、Pr1酶基因表達量與其毒力的相關性

王宏民，李赫，張天浩，張仙紅

1 山西農業大學 經濟管理學院，山西 太谷 030801

2 山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801

蟲生真菌在入侵寄主的過程中，通過分泌蛋白酶、幾丁質酶和脂酶等多種水解酶來降解昆蟲體壁[1]，從而入侵寄主昆蟲。其中絲氨酸彈性凝乳蛋白酶Pr1是一類能高效降解昆蟲體壁蛋白的重要酶[2]。據報道，球孢白僵菌Pr1酶在球孢白僵菌侵入蟲體過程中起重要作用，且經過基因改良可過量分泌蛋白酶和幾丁質酶的白僵菌菌株其毒力顯著增強[3]；綠僵菌中也已發現有10種絲氨酸彈性凝乳蛋白酶 (Pr1A-Pr1K)，且將Pr1基因導入綠僵菌中超量表達獲得的重組菌株其侵染力明顯提高[4]；玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea表皮蛋白酶基因敲除型菌株對煙粉虱若蟲的致死率顯著低于對照[5]。可見，Pr1酶是蟲生真菌的一個重要的毒力因子。

玫煙色棒束孢是一種地理分布廣泛、昆蟲寄主多樣的蟲生真菌。早在1961年，有關學者就開始利用感染玫煙色棒束孢的棉鈴蟲進一步感染黏蟲、斜紋夜蛾和銅綠金龜子的幼蟲[6]。用玫煙色棒束孢北京變種顯著降低了溫室黃瓜上的白粉虱的種群數量[7]。近年來，有關玫煙色棒束孢致病機理[8-11]、毒力基因克隆和表達[12]、致病相關基因的差異表達[13]等已陸續得到了研究。毒力基因高表達是提高昆蟲病原真菌毒力和進一步擴大真菌殺蟲劑應用的有效手段[14]。那么不同毒力的菌株其Pr1蛋白酶基因的表達是否存在差異，這種差異與其毒力的相關性如何，目前還未見報道。本試驗采用熒光定量PCR技術檢測了毒力不同的玫煙色棒束孢菌株Pr1酶基因的表達量，旨在探討玫煙色棒束孢Pr1酶活力、Pr1酶基因表達量與其毒力之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

玫煙色棒束孢Pf-9606、Pf-7606、Pf-904、Pf-941、Pf-14菌株保存于山西農業大學昆蟲實驗室。

1.2 供試昆蟲

采集個體大小一致的無翅桃蚜，用新鮮離體的桃樹葉片 (葉柄用濕棉球包裹) 在 (25±1)℃、相對濕度 (75±5)%、12 L∶12 D光照條件下進行飼養。

1.3 供試藥劑

Pr1 蛋白酶專一性短肽底物 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，購自Sigma公司。

試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AH311)、TransStart Tip Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech) 有限公司。

考馬斯亮藍染色液：0.1 g/L考馬斯亮藍G-250，47 g/L乙醇，85 g/L磷酸。

冰醋酸、EDTA均為分析純。

1.4 毒力測定

對桃蚜的毒力測定采用坡塔噴霧法。取PDA培養基 (馬鈴薯200 g，葡萄糖200 g，瓊脂200 g，蒸餾水1 L) 上培養10 d的供試菌株的分生孢子，用無菌水配制成1×107孢子/mL的孢子懸浮液，每個培養皿中放入30頭桃蚜，用坡塔噴霧器進行噴霧，每皿噴霧量設置為1 mL，沉降時間為40 s。每處理3次重復，用無菌水作對照。逐日定時觀察、記錄各個處理的桃蚜死亡情況，并將死亡蚜蟲尸體移出放入消毒的培養皿中，26 ℃保濕培養。采用SPSS軟件進行數據處理。

1.5 Pr1蛋白酶活性測定

粗酶液的制備：將濕重7.5 g的菌絲接入100 mL基本鹽培養基 (NaCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，K2HPO40.3 g/L) 中，于26 ℃、180 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，除去菌體得到粗酶液。

菌株Pr1蛋白酶活性的測定參照Gille-spie等專一性短肽底物法[15]。將1.4 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)、50 μL粗酶液和50 μL Pr1底物混勻，28 ℃、180 r/min搖床振蕩10 min，冰浴1 min后終止反應，410 nm測定混合液的吸光率，用50 μL DMSO代替Pr1底物設為空白對照。每個菌株3次重復。酶活單位定義：以pH 8.0、28 ℃使反應混合物每分鐘的OD410平均增加0.01的酶量為一個酶活單位，酶活以活力表示，計算比酶活 (單位：U/mg)。

數據處理：運用SPSS軟件進行一元線性回歸分析，將供試菌株的Pr1酶活力與致病力進行相關性分析。

1.6 蛋白質濃度測定

利用考馬斯亮藍法，以牛血清白蛋白為標準品，測定蛋白含量。

1.7 Pr1蛋白酶基因表達量測定

1) 按照TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取供試菌株的總RNA；恒壓300 V，1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳5 min檢測RNA；取1 μL RNA樣品，用紫外分光光度計測定提取的各樣品的總RNA濃度及OD260/OD280值。

2) 使用 TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (AH311)試劑盒，反轉錄玫煙色棒束孢的RNA樣品。反應體系包含1 μg Total RNA、10 μL 2×TS II Reaction Mix、1 μL TransSctipt II RT/RI Enzyme Mix、0.5 μL Random Primer (0.1 μg/μL)、0.5 μL Anchored Oligo (dT)20 Primer (0.5 μg/μL) 和1 μL gDNA Remover及20 μL RNase-free Water。先將RNA模板、引物與RNase-free Water混勻，65 ℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后再加入其他反應組分，50 ℃孵育反轉錄15 min；85 ℃加熱5 min失活TransScript II RT/RI和gDNA Remover。

3) 熒光定量PCR引物設計見表1：根據湯強提交的IfuPr1的cDNA序列 (GenBank登錄號FJ423001.1)[12]，用Primer Premier 5軟件設計qPCR引物，以延長因子 (Elongation factor) 基因作為內參基因。

表1 引物設計Table 1 Design of primer

4) 熒光定量反應體系和條件：使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒，反轉錄玫煙色棒束孢的RNA樣品，反應體系包含1 μL Template、0.4 μL Forward Primer (10 μmol/L)、0.4 μL Reverse Primer (10 μmol/L)、10 μL 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix、0.4 μL Passive Reference Dye (50×，optional)、20 μL ddH2O。

PCR 反應程序：94 ℃預變性 30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40-45個循環。

5) 數據處理：當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用2–△△CT法計算不同玫煙色棒束孢Pr1蛋白酶基因相對于對照組的表達量，不同菌株間差異顯著性用SPSS進行單因素的新復極法數據分析。所有數據用±s表示。柱狀圖用軟件Excel繪制。

目的基因的相對表達水平=目的基因與內參基因的倍數差異 (未知樣本) /目的基因與內參基因的倍數差異 (對照樣本)。

Relative Quantity=2–△△CT。

6) Pr1酶活力、基因表達量與毒力的關系：運用SPSS軟件進行多元線性回歸分析，多重比較運用了共線性分析法。將供試菌株的Pr1酶活力、蛋白酶Pr1基因表達量與致病力進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 供試菌株對桃蚜的毒力及Pr1酶活力

供試菌株對桃蚜的毒力及不同菌株的Pr1酶活力如表2所示。由表2可知，不同菌株對桃蚜的毒力及Pr1酶活力存在一定的差異。其中菌株Pf 904毒力最高，對桃蚜的致病力達94.13%，致死中時最短為2.29 d，Pr1酶活力最高為0.085 7 U/mg；其次為Pf 7606菌株，其毒力和酶活均顯著低于Pf 904菌株，其他供試各菌株毒力的變化趨勢與Pr1酶活力變化基本一致。

2.2 Pr1蛋白酶基因表達量

由圖1可知，供試玫煙色棒束孢不同菌株Pr1酶基因表達量存在一定差異。玫煙色棒束孢Pf 904和7606的基因表達量較高，且這兩菌株的毒力也最高，分別為對照的5.9倍和5.8倍；而玫煙色棒束孢14、9606、941的基因表達量較低，依次為對照的5.2、4.8、3.1倍，且其毒力也呈逐漸趨勢。

2.3 供試菌株的致病力、Pr1酶活力及表達量的相關性分析

2.3.1 供試菌株Pr1酶活力與毒力的相關性

以Pr1酶活力為自變量，毒力為因變量，采用SPSS皮爾遜相關分析法，分析自變量與因變量的相關性及自變量對因變量的被貢獻程度。對供試5菌株的Pr1酶活力與致病力作散點圖，經線性趨勢擬合，得到不同菌株的Pr1酶活力與致病力的線性回歸分析方程：y=3.64x+0.62，R2=0.432，相關系數達到了極顯著水平 (圖2)。由此可知，Pr1酶活力與供試菌株的致病力呈正相關，菌株的Pr1蛋白酶活性越高，致病力越強。

表2 供試菌株對桃蚜毒力及Pr1酶活力Table 2 Virulence and Pr1 protease activity of tested strains

圖1 各菌株Pr1基因相對表達量Fig.1 Pr1 gene relative expression of the strains.

圖2 玫煙色棒束孢及球孢白僵菌Pr1酶活力與菌株致病力的相關性Fig.2 The correlation between Pr1 protease activity and strain lethality of I.fumosorosea and B.bassiana.

2.3.2 供試菌株Pr1酶活力、基因表達量與毒力的關系

以Pr1酶活力、Pr1基因表達量為自變量，毒力為因變量，采用SPSS共線性分析，分析了自變量與因變量的相關性與自變量之間的交互作用。結果表明，殘差符合正態分布 (圖3)，散落各點符合多元線性回歸方程 (圖4)，殘差排列散亂毫無規律，說明結果比較理想 (圖5)。

對供試菌株Pr1酶活力、Pr1基因表達量與致病力進行多元線性回歸分析，得到方程為y=0.236+10.833x1–0.039x2(x1=Pr1酶活力，x2=Pr1基因表達量)：調整R2=0.568，說明線性擬合方程能很好地反映原始數據；序列相關系數D-W為2.444，表明方程不存在序列相關，不是偽回歸方程；P(x1=0.367，x2=0.512)<0.05，表明Pr1酶活力、Pr1基因表達量對致病力有顯著影響；VIF=12.705，證明Pr1酶活力、Pr1基因表達量存在中度多重共線性。由此可知，Pr1蛋白酶基因表達量與Pr1酶活呈正相關，Pr1蛋白酶活力與菌株的致病力呈正相關，故Pr1蛋白酶活力、Pr1蛋白酶基因表達量均與菌株的致病力存在著一定程度的共線性。

圖3 殘差直方圖Fig.3 Histogram of residuals.

圖4 回歸標準化殘差的標準P-P圖Fig.4 Standardized regression residuals of the standard P-P figure.

圖5 殘差散點圖Fig.5 Residual scatterplot.

3 結論與討論

多數研究表明，昆蟲病原真菌分泌的蛋白酶活力與其毒力之間存在密切聯系[16]，如球孢白僵菌菌株的胞外蛋白酶產酶水平高低決定了其對紅脂大小蠹致病力的強弱，二者之間呈明顯的線性關系[17]；蟬擬青霉胞外蛋白酶活性與對蚜蟲的致病力的作用效率具有相關性[18]；白僵菌不同菌株的酶活力與其對害蟲的致病力關系為一次函數[19]；球孢白僵菌GXU-Bb及其分離子菌株GXU-Bb16、GXU-Bb10、GXU-Bb13和GXU-Bb05兩種類型的菌株產酶水平的高低差異與其對小菜蛾的致病力間有顯著或極顯著相關性[20]。本試驗也表明，供試的玫煙色棒束孢Pr1酶活力與其毒力存在線性關系，且相關系數達到了極顯著的水平。可見進行玫煙色棒束孢高毒力菌株的初步篩選時，Pr1酶活力可作為一個重要的參考指標。但由于昆蟲病原真菌在侵染昆蟲體表時分泌一系列的體壁降解酶，而不同酶對不同體壁成分結構的昆蟲發揮的作用可能不完全相同，因此，應進一步深入研究玫煙色棒束孢在侵染不同目昆蟲時其蛋白酶活力與其毒力的相關性。

據St Leger等報道，將Pr1基因導入綠僵菌中超量表達獲得的重組菌株其侵染力明顯提高；增加綠僵菌Pr1基因的拷貝數使其超量表達蛋白酶Pr1，不僅極大地提高了綠僵菌的毒力，而且使其對寄主昆蟲的致死時間縮短了25%；通過基因工程手段促使綠僵菌超量表達降解表皮的蛋白酶PR1，可構建高毒力殺蟲綠僵菌工程菌株[4]，可見毒力基因高表達是提高昆蟲病原真菌毒力和進一步擴大真菌殺蟲劑應用的有效手段。本試驗通過熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測發現，玫煙色棒束孢不同菌株Pr1蛋白酶基因的表達量與Pr1酶活呈正相關，且不同菌株Pr1基因表達量差異與菌株本身的毒力大小一致，也與本研究生物測定的結果一致。可見，Pr1基因的表達量和Pr1蛋白酶的活力對玫煙色棒束孢菌株的篩選具有重要作用。

本研究采用熒光定量PCR方法，以EF延伸因子為內參，建立了一種快速準確檢測不同菌株Pr1蛋白酶基因表達量的方法。該方法方便、高效，并具有良好的重復性，可用于玫煙色棒束不同菌株同一基因表達量的檢測，這為高效篩選性狀優良菌株提供了有效的技術手段。