魔芋葡甘露聚糖對酶解青花椒籽仁谷蛋白乳液穩定性的影響

瞿瑗，侯曉艷，黎杉珊，申光輝，羅擎英，吳賀君，蒲彪，葉萌，張志清*

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川農業大學 林學院，四川 溫江，611130)

乳液體系是由分散相和連續相組成的熱力學不穩定體系，易發生分層、絮凝、聚結、相轉化、奧斯特瓦爾德熟化[1]。通常可以通過添加一些表面活性組分來穩定乳液，如蛋白質、表面活性劑、磷脂等[2]。乳液中添加蛋白質，可降低界面張力并形成黏彈性薄膜，所以可以有效地穩定分散體系[3]。多糖由于其增稠和凝膠特性常被應用于食品工業中。乳液中添加多糖，可以使其吸附到液滴表面并形成保護層，進一步提高蛋白質乳液的穩定性[4]。有研究表明，蛋白質乳液在蛋白質等電點附近和高鹽濃度下易發生聚集，乳液極不穩定[5-6]，由于界面電荷、結構和界面層厚度的差異，被蛋白質-多糖復合物包覆的油滴對環境壓力(pH，離子強度和熱處理)比單獨用蛋白質包裹的油滴更耐受[7-8]。而多糖提高蛋白質乳液穩定性的能力取決于所用蛋白質和多糖的性質以及界面絡合期間和之后的環境條件[9]。應用蛋白質-多糖復合物制備穩定的乳液有2種途徑：(1)將多糖添加到由蛋白質和油形成的初乳液中，通過逐層組裝方式，使多糖吸附到蛋白質表面[10]；(2)先將蛋白質和多糖混合，形成可溶性復合物，再加入油進行乳化，使蛋白質-多糖復合物吸附到油滴表面[11]。目前已有許多關于通過添加多糖來穩定蛋白乳液的研究，比如大豆多糖-乳清蛋白乳液[12]、羧甲基纖維素鈉-β-乳球蛋白乳液[13]、羧甲基纖維素鈉-牛奶蛋白乳液以及瓜爾豆膠-牛奶蛋白乳液[14]。

青花椒籽蛋白是一種優質蛋白質[15-16]，其中谷蛋白是青花椒籽仁中主要的儲存蛋白[17]。然而，由于其水溶性較差，作為乳化劑的應用受到了限制，課題組前期研究發現，蛋白的溶解性和乳化特性可以通過適當的酶解來提高[18]。水解度為6%的青花椒籽仁谷蛋白可以形成較穩定的乳液，但是乳液的熱穩定性較差，當pH值或離子強度改變時，液滴易發生聚集，乳液不穩定，這將極大地限制青花椒籽仁谷蛋白作為乳化劑應用于食品工業中。魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan,KGM)是一種中性線性多糖，可以用于乳液中提高其物理穩定性[19]。迄今為止還沒有關于魔芋葡甘露聚糖對酶解青花椒籽仁谷蛋白乳液穩定性影響的研究。通過蛋白質-多糖復合物來穩定乳液往往受環境溫度、pH、離子強度以及制備方法的影響。因此，本文研究了影響酶解青花椒籽仁谷蛋白-魔芋葡甘露聚糖(HZADSKG-KGM)復合物包裹油滴形成穩定乳液的主要因素，分析了該乳液對環境壓力(pH，離子強度和熱處理)的穩定性，以期對生物大分子作為天然穩定劑應用于食品工業中提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青花椒籽(ZanthoxylumarmatumDC.)，采自四川省金陽縣青花椒產地；魔芋葡甘露聚糖,成都光禾商貿有限公司；胰蛋白酶(酶活力>2.5×105U/g)，上海瑞永生物科技有限公司； NaCl、NaOH、HCl等，均為分析純，科龍化工試劑廠。

1.1.2 主要儀器

FW-100高速萬能粉碎機，北京中興偉業儀器有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Thermo BR4i離心機，美國THERMO公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學有限公司；PHS-3C酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；DHG-9101電熱恒溫干燥箱，上海三發科學儀器有限公司；Sartorius CP225D電子天平，德國SARTORIUS公司；JHQ-Q54-P70高壓均質機，鄭州玉祥食品機械有限公司；FJ-200-SH型數顯高速分散均質機，上海右一儀器有限公司；Rise系列-2006型激光粒度分析儀，濟南潤之科技有限公司；FV1200型激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 測試樣品制備

(1)制備青花椒籽仁谷蛋白

參考DASH等[20]的方法并適當修改。稱取10 g脫脂青花椒籽仁，加入10倍的蒸餾水，攪拌30 min，8 000 r/min離心20 min，去除上清液；加入10倍質量分數為2%的NaCl溶液，重復以上操作，去除上清液；再次加入10倍體積分數為70%的乙醇溶液，重復以上操作，去除上清液；最后加入10倍質量分數為0.5%的NaOH溶液，重復以上操作，收集上清液，提取谷蛋白，室溫下調節pH值至3.3，4 000 r/min離心20 min后，取沉淀物于4 ℃透析48 h，冷凍干燥備用。青花椒籽仁谷蛋白純度達96.25%(干基，N%×6.25)。

(2)水解青花椒籽仁谷蛋白(HZADSKG)的制備

具體參考ELAVARASAN等[21]的方法并適當修改。將5 g青花椒籽仁谷蛋白加入到100 mL蒸餾水中，連續攪拌1 h。然后將pH值和溫度調到所需值(pH=8，50 ℃)后加入0.1 g胰蛋白酶進行水解。酶解22.3 min后，于95 ℃下加熱5 min滅活，迅速冰浴冷卻至室溫，離心取上清液后凍干備用。采用pH-stat法[14]測定水解度。最后獲得水解度為6%的青花椒籽仁谷蛋白乳液。

(3)制備初級乳液

參考TAN等[22]的方法并適當修改。分別將5 g/L的蛋白質和5 g/L的魔芋葡甘露聚分散于10 mmol/L(pH=7.0)的磷酸鹽緩沖溶液中，并在室溫下水化至少2 h以保證其完全溶解。采用高速分散均質機將質量濃度為100 g/L玉米油與質量濃度為900 g/L蛋白溶液(0.5%)預混勻，12 000 r/min攪拌2 min，然后使用高壓均質機，在30 MPa下高壓均質3次，制備初級乳液。

(4)制備二級乳液

在初級乳液的基礎上，加入一定比例的魔芋葡甘露聚糖溶液和磷酸鹽緩沖溶液，混勻，高速攪拌0.5 h，最終得到二級乳液，然后加入質量濃度為0.2 g/L疊氮化鈉以防止微生物生長。

(5)確定魔芋葡甘露聚糖最佳濃度

調節初級乳液的pH值為3和7，隨后加入一定比例的魔芋葡甘露聚糖溶液和磷酸鹽緩沖溶液，混勻，高速攪拌0.5 h，最終得到二級乳液(質量分數為1%玉米油，質量分數0.05%的青花椒籽仁谷蛋白，質量分數為0～0.5%的魔芋葡甘露聚糖)。

1.2.2 乳液穩定性的測定

(1)pH穩定性

將初級乳液和二級乳液用 0.5 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH調節pH值為2～7，攪拌混勻，室溫下放置1 d后測定樣品的粒徑大小和微觀結構，觀察其乳析現象。

(2)離子強度穩定性

調節初級乳液和二級乳液的pH值至3。分別添加不同濃度的NaCl(0～500 mmol/L)于樣品中，攪拌混勻，室溫下放置1 d后測定樣品的粒徑大小和微觀結構，觀察其乳析現象。

(3)熱處理穩定性

調節初級乳液和二級乳液的pH值至3。分別于30～90 ℃下水浴 30 min后迅速冷卻至室溫。室溫下放置1 d后測定樣品的粒徑大小和微觀結構，觀察其乳析現象。

1.2.3 指標測定

(1)乳液平均粒徑的測定

采用Rise系列-2006型激光粒度分析儀對乳液的平均粒徑進行測定[23]。樣品用相同pH值及離子強度的緩沖液稀釋100倍以消除光散射效應，在25 ℃條件下進行測定。

(2)微觀結構測定

根據TAN等[22]的方法采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)對乳液的微結構進行觀察。尼羅紅溶于乙醇中(1 mg/mL)，異硫氰酸熒光素(FIFC)溶于二甲基亞砜中(10 mg/mL)。配好的染料避光保存。1 mL乳液樣品分別與0.1 mL尼羅紅和0.1 mL FITC混合后，取8 μL樣品于載玻片中心，在蓋玻片四周涂上指甲油避免水分散失。采用60倍油鏡進行觀察。選擇 488 nm的Ar離子作為激發波長，515 nm和621 nm分別作為綠色及紅色的發射波長，采集熒光圖像。

1.3 數據處理

每次實驗重復3次，采用SPASS 20.0進行Tukey檢驗分析樣品之間的顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 魔芋葡甘露聚糖濃度對乳液穩定性的影響及最佳濃度確定

圖1為不同濃度魔芋葡甘露聚糖(0～0.5 wt%)對乳液穩定性的影響。在圖1-a中，pH值為3的初級乳液的平均粒徑較大，為6.18 μm，pH值為7的初乳液的平均粒徑較小，為1.48 μm。當魔芋葡甘露聚糖的濃度超過0.1%時，pH 3和pH 7條件下乳液的平均粒徑都顯著降低，當魔芋葡甘露聚糖濃度為0.3%時，乳液的平均粒徑均最小，表明此時魔芋葡甘露聚糖的吸附能夠增加靜電斥力和空間斥力，從而能夠避免蛋白質在等電點附近的聚集；當魔芋葡甘露聚糖濃度為0.4%和0.5%時，乳液的平均粒徑又顯著增大。

圖1-b為乳液的宏觀穩定性，與平均粒徑變化結果一致。當pH值降至3時初級乳液分層，由于此pH值接近蛋白質等電點，蛋白質凈電荷的缺失導致乳滴間缺乏靜電斥力而發生絮凝和聚結[24]；當pH值為7時，由于帶電液滴間存在強烈的靜電斥力可以有效抑制液滴發生聚集，初乳液很穩定。當魔芋葡甘露聚糖濃度為0.01%～0.2%時，pH值3條件下的乳液不穩定，發生乳析現象，表明低濃度的魔芋葡甘露聚糖促進乳液聚集，這可能是由于加入多糖后，液滴表面電荷降低，使得液滴之間的靜電斥力降低進而發生聚集；此外，當多糖濃度較低時，單個多糖分子不能完全包裹整個油滴，導致多個油滴表面吸附1個多糖分子，進而導致橋聯絮凝[25]。當魔芋葡甘露聚糖濃度超過0.4%時， pH 3和pH 7條件下的乳液平均粒徑均顯著增加，但是乳液保持穩定。在乳液中添加非吸附多糖可以使油滴間的吸引滲透力增加，從而導致損耗絮凝[26]。因此，當多糖濃度超過臨界濃度時，液滴發生絮凝，從而促進乳液聚結。但是，魔芋葡甘露聚糖未使乳液發生乳析現象可能是由于魔芋葡甘露聚糖能夠增加乳液體系的黏性，從而降低液滴絮凝的速度。以上結果表明， 0.3%的魔芋葡甘露聚糖濃度為使乳液穩定的最適添加濃度。

a-pH 3和pH 7的平均粒徑；b-24 h后乳液的表觀特性；不同小寫字母表示差異顯著，下同。

圖1 魔芋葡甘露聚糖濃度對青花椒籽仁谷蛋白乳液在(a)pH 3和pH 7的平均粒徑以及(b) 24 h后乳液的表觀特性的影響

Fig.1 Influence of KGM concentration on(a) the mean particle diameter of oil-in-water emulsions at pH 3 and pH 7;(b) macroscopical characteristics of emulsions after 24 h storage at pH 3 and pH 7

2.2 pH值對乳液穩定性的影響

pH值對初級乳液和二級乳液穩定性的影響如圖2所示。從圖2-a中可以看出，隨著pH值的增大，初乳液平均粒徑顯著降低，二級乳液的平均粒徑在pH 5之前顯著性降低，pH 5～7之間無明顯變化。圖2-b結果與平均粒徑變化一致。初級乳液在pH 7條件下穩定，在pH 2～6情況下出現明顯的乳析現象。這可能是由于在蛋白質等電點附近液滴電荷減少，靜電斥力減弱造成的[24]。添加了魔芋葡甘露聚糖的二級乳液在pH 5～7范圍內保持相對穩定，乳液未分層。結果表明，魔芋葡甘露聚糖對提高青花椒籽仁谷蛋白乳液的穩定性有顯著效果。由于魔芋葡甘露聚糖分子吸附在液滴表面的蛋白分子上，形成較厚的帶電界面層，從而增加液滴之間的靜電斥力和空間位阻，進而抑制乳液聚集。而乳液在pH 2～4條件下不穩定，發生了聚集。魔芋葡甘露聚糖含有若干個包含幾個殘基長度的支鏈，是一種線性結構，可以延伸至水相中，不能產生較強的位阻排斥[27]。圖2-c為乳液的激光共聚焦微觀結構，在pH值3時，初乳液中的液滴發生了明顯聚集，這是因為液滴間靜電斥力較弱。加入魔芋葡甘露聚糖后，乳液在此pH值下也出現了液滴聚集現象。在pH值7時，初乳液的小油滴均一分布，表明液滴間存在較強的靜電斥力來抑制乳液的聚集。二級乳液在此pH值條件下保持穩定，這歸因于液滴間強烈的靜電斥力作用，且魔芋葡甘露聚糖的濃度還不至于引起損耗絮凝。激光共聚焦結果與表觀特性結果一致。

圖2 pH值對魔芋葡甘聚糖存在和不存在時(a)乳液平均粒徑 ；(b)放置24 h后的表觀特性;(c)微觀結構的影響(標尺20 μm)

Fig.2 Influence of pH values in the absence and presence of KGM on (a) mean particle diameter of emulsions；(b)macroscopic characteristics of emulsions after 24 h storage;(c)microstructures of selected emulsions (the ruler：20 μm)

2.3 離子強度對乳液穩定性的影響

NaCl對魔芋葡甘露聚糖-蛋白乳液在pH值3時的平均粒徑變化如圖3所示。

圖3 NaCl濃度對魔芋葡甘露聚糖-青花椒籽仁谷蛋白乳液(a)平均粒徑; (b)放置24 h后的表觀特性；(c)微觀結構的影響(標尺為20 μm)

Fig.3 Influence of NaCl concentration in the presence of KGM on (a) mean particle diameter of emulsions; (b)macroscopic characteristics of emulsions after 24 h storage; (c) microstructures of selected emulsions (the ruler: 20 μm)

由圖3-a可知，隨著NaCl濃度的增大，乳液的平均粒徑顯著增大。從圖3-b可以看出，二級乳液在0～400 mmol/L NaCl下保持穩定，在500 mmol/L NaCl下發生聚集,出現明顯的分層。這表明添加了魔芋葡甘露聚糖后，吸附了多糖分子的液滴之間的靜電斥力和空間位阻遠大于范德華力和疏水相互作用[28]。但是當NaCl濃度達到一個臨界值時，液滴發生聚集，發生乳析。這可能因為加入高濃度的NaCl后，由于靜電屏蔽作用使得液滴之間的靜電斥力減弱[29]；另外，高濃度的NaCl可能會使液滴表面的蛋白-多糖的吸引力(范德華力和疏水相互作用)降低，使得某些多糖分子吸附到多個液滴表面，進而引起橋聯絮凝。圖3-c為乳液的微觀結構，低濃度的NaCl條件下，二級乳液微觀結構未發生較大變化，但是在高濃度鹽離子下，二級乳液發生聚集。微觀結構進一步驗證了前面的平均粒徑變化以及表觀特性結果。SALMINEN等[30]研究指出，通過添加果膠可以顯著提高乳清蛋白乳液的鹽離子穩定性(0～500 mmol/L NaCl)，本文結果支持了上述觀點。

2.4 溫度對乳液穩定性的影響

從圖4中可以看出，經熱處理(30～90 ℃)后乳液保持穩定，未出現乳析現象(圖4-b)，但是隨著溫度的升高，二級乳液的平均粒徑有所增大，60 ℃下達到最小(圖4-a)。從圖4-c可以看出，90 ℃處理的乳液液滴較30 ℃的大，但是液滴分布均勻，這與表觀特性中未發現乳析的結果一致。

圖4 溫度對魔芋葡甘露聚糖-青花椒籽仁谷蛋白乳液(a)平均粒徑；(b)放置24h后的表觀特性；(c)微觀結構的影響(標尺為20 μm)

Fig.4 (a) Influence of temperature on mean particle diameter of emulsions; (b)macroscopic characteristics of emulsions after 24 h storage; (c) microstructures of selected emul-sions (the ruler: 20 μm)

SALMINEN等[30]研究指出，通過添加果膠可以極大提高乳清蛋白乳液的熱處理穩定性(40～90 ℃)，XIANG等[31]研究結果也與之近似。本研究中由于魔芋葡甘露聚糖的存在，導致的液滴間有強烈的靜電斥力和空間位阻，從而增加了乳液的熱穩定性，進一步證實了上述研究理論。

3 結論

本文研究結果表明，魔芋葡甘露聚糖濃度對穩定青花椒籽仁谷蛋白乳液有重要作用。魔芋葡甘露聚糖的存在顯著提高了青花椒籽仁谷蛋白乳液的pH穩定性、離子強度穩定性以及熱處理穩定性。魔芋葡甘露聚糖主要是通過增加液滴之間的靜電斥力和空間斥力來提高乳液穩定性。本文結果進一步認識了多糖與蛋白乳液穩定性的作用關系和機制，同時對青花椒籽仁谷蛋白作為乳化劑在食品中的應用提供了理論基礎。