復合菌株共培養制曲改善郫縣豆瓣成曲酶系活力

陳廷廷，胡瓊，唐潔，雷丹，朱純瑩，張慶，向文良

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

郫縣豆瓣是川味食譜中常用的調味佳品，有“川菜之魂”之稱，它是以脫殼蠶豆為蛋白質原料，與面粉混合后經微生物作用發酵制成的一種半流動狀態黏稠的調味品，具有辣而不燥、鮮紅油潤、回味香醇的特點[1]。蠶豆曲的制備是郫縣豆瓣制作的一個關鍵過程，發酵階段利用蠶豆曲中微生物生長繁殖產生的酶系，將原料中的蛋白質、淀粉等分解成多肽、游離氨基酸、糖類等小分子物質[2]，這些物質對豆瓣醬風味及色澤的形成起著至關重要的作用，因此提高豆瓣成曲酶活力，是豆瓣生產中最重要的質量控制點。

復合菌株制曲主要是利用多菌株共培養制曲過程中分泌的酶系進行互補，來提高原料利用率、氨基酸生成率，以增強產品風味[3]。近年來，不少學者都致力于復合菌株制曲在傳統釀造醬制品中的研究，林曉華等[4]在傳統生產工藝的基礎上利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，對豆豉制曲工藝條件進行了優化；PENG等[5]對醬油發酵過程中酶活力、抗氧化劑和酚類化合物進行了研究，發現米曲霉HG-26和黑曲霉HG-35混合制曲比單菌制曲發酵能力高。然而采用復合菌株制曲在郫縣豆瓣中的研究和應用還鮮有報道。

傳統郫縣豆瓣生產是以霉菌為主要微生物經自然發酵而成[6]。目前，郫縣豆瓣生產企業大都采用純種米曲霉單一菌株制曲，而米曲霉主要以產中性蛋白酶為主，產酸性蛋白酶和纖維素酶能力較弱[7]。這些中性蛋白酶在發酵過程中的偏酸性條件下往往受到抑制，導致原料利用率低、產品風味不足[8]。黑曲霉產酸性蛋白酶和纖維素酶等活力較強，尤其是產酸性蛋白酶活力遠高于米曲霉[9]，因此，在郫縣豆瓣制曲中如能利用米曲霉和黑曲霉菌株共培養制曲，可有效彌補單一米曲霉制曲中酶活力不足、產品氨基酸態氮含量低、鮮味不足等缺點。

本研究從傳統釀造醬制品中分離篩選高產蛋白酶優勢米曲霉和黑曲霉菌株，進行了形態學和分子生物學鑒定，利用米曲霉和黑曲霉共培養制曲，對制曲過程中的主要酶系活力進行研究，旨在為生產優質郫縣豆瓣提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

傳統釀造郫縣豆瓣,四川省郫縣豆瓣股份有限公司；醬油醬醅，千禾味業食品股份有限公司；麩皮、豆粕、蠶豆、面粉,郫縣紅光農貿市場。

福林試劑、氯化鈉、無水葡萄糖、麥芽糖、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼砂、氫氧化鈉、干酪素、L-酪氨酸、鹽酸、酒石酸鉀鈉、二硝基水楊酸、重苯酚、亞硫酸鈉、1水檸檬酸、2水檸檬酸鈉、淀粉、對硝基苯胺,成都科龍化工試劑廠；乳酸,天津市科密歐化學試劑有限公司；乳酸鈉,天津市光復精細化工研究所；L-亮氨酸對硝基苯胺,上海麥克林生化科技有限公司；DNA提取試劑盒、DNA Marker、TaqDNA連接酶、dNTPs,北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-320酸度計,成都世紀方舟科技有限公司；SGSP-02電熱恒溫隔水式培養箱,黃石市恒豐醫療器械有限公司；HNY-2102C恒溫培養振蕩器,天津市歐諾儀器儀表有限公司；WFJ7200型可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司；E200MV生物顯微鏡,南京尼康江南光學儀器有限公司；BPG-9070A精密鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司；Biometra PCR儀,德國Analytik Jena AG公司；Powerpac Basic凝膠成像系統,美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要培養基

察氏培養基：蔗糖30 g， NaNO33 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.0～6.5。

酪蛋白培養基：干酪素4 g，KH2PO40.36 g，Na2HPO41.07 g，ZnCl20.014 g，NaCl 1.2 g，CaCl20.002 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.002 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.5～7.0。

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g切塊，加1 000 mL蒸餾水煮沸20 min，紗布過濾，補蒸餾水至1 000 mL，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH值自然。

種曲培養基：麩皮8 g，豆粕2 g，蒸餾水5 mL，封裝后121 ℃滅菌20 min[10]。

1.3.2 菌株篩選

用無菌生理鹽水對郫縣豆瓣、醬醅分別進行梯度稀釋，選擇適當濃度的稀釋液在察氏培養基上涂布分離，30 ℃倒置培養，觀察，篩選單菌落進行劃線分離，多次分離純化直到得到純培養物；挑選生長較快、菌絲粗壯的單菌落用點接法點接到酪蛋白篩選培養基，30 ℃培養3 d，觀察記錄透明圈直徑D和菌落直徑d之比，挑選D/d值較大的菌落接種于PDA培養基斜面保存[11]。

1.3.3 菌株鑒定

1.3.3.1 菌株的形態學觀察

在PDA固體培養基中30 ℃培養3 d，參照《真菌鑒定手冊》對菌株進行形態學鑒定[12]。

1.3.3.2 菌株的分子學鑒定

采用真菌試劑盒提取菌株基因組DNA，用真菌基因序列擴增通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)擴增真菌的ITS序列[13]。50 μL反應體系：模板DNA 1.5 μL，ITS4 1 μL，ITS5 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，Mixed dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 40 μL；PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，30個循環，最后于72 ℃保溫擴展10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并將擴增產物連接到pGM-T載體后克隆入感受態細胞E.coliDH5α中，提取重組質粒對ITS序列測序[14]，所得序列提交至NCBI進行Blast比對。通過BLAST程序將所測的序列和NCBI GenBank數據庫進行同源性比較，然后利用MEGA 7.0軟件和Neighbor-Joining法構建系統發育樹[15]。

1.3.4 單菌株及復合菌株共培養制曲酶活力分析

1.3.4.1 豆瓣制曲工藝流程

1.3.4.2 種曲制備

將分離獲得的霉菌菌懸液(孢子濃度107個/mL) 按1%的接種量分別接種到種曲培養基上，置于30 ℃培養72 h，定時翻曲，防止曲料結塊[16]。

1.3.4.3 單菌株制曲

脫殼蠶豆95 ℃開水漂燙3 min后，放入40 ℃溫水攪拌冷卻5 min，蠶豆與面粉質量比為4∶1，種曲接種量0.5% (種曲質量占蠶豆與面粉總質量)，先將種曲與面粉混合均勻，再裝入三角瓶與蠶豆充分混合，8層紗布包扎，30 ℃培養，期間定時翻曲[17]，分別對單菌株制曲過程中曲料變化進行監測[24]。

1.3.4.4 復合菌株共培養制曲

方法同1.3.4.3，蠶豆與面粉質量比為 4∶1，種曲接種量0.5%(種曲質量占蠶豆與面粉總質量)，米曲霉、黑曲霉接種質量比為3∶1[18]，對復合菌株制曲過程中曲料變化進行監測。

1.3.4.5 樣品粗酶液的制備

稱取5 g蠶豆曲于研缽中充分研磨，少量多次加入25 mL相應pH緩沖溶液，生理鹽水定容至100 mL，40 ℃水浴提取1 h，每隔10 min攪動1次，離心取上清液，即得粗酶液[19]。

1.3.4.6 酶活力測定方法

蛋白酶活力：采用福林酚法[20]，酶活力定義為：在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

淀粉酶活力：采用DNS法[21]，酶活力定義為：在40 ℃下每分鐘水解可溶性淀粉產生1 mg麥芽糖，定義為1個淀粉酶活力單位。

纖維素酶：采用DNS法[22]，酶活定義為：在50 ℃下每小時水解底物CMC生成1 μmol葡萄糖所需酶量，定義為1個酶活單位。

氨肽酶：參照CHIEN等[23]的方法，在40 ℃下每分鐘分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生1 μg對硝基苯胺所需酶量，定義為1個酶活單位。

1.3.5 數據處理

每組實驗3個水平取平均值，利用Origin 8.0軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

2.1.1 菌株的分離與篩選

分離純化得到23株霉菌，分別編號為QM-1～QM-12以及QH-1～QH-11，其中篩選到出現酪蛋白水解圈菌株分別有6株和5株，初步測定其HC值，結果如表1所示，選取D/d值較大的2株菌QM-6和QH-3用于后續實驗。

表1 產蛋白酶菌株篩選

2.1.2 菌株的形態學特征

菌株QM-6在PDA培養基上30 ℃培養，菌落初始呈白色，24 h后開始長孢子，初為嫩綠色，后逐漸變為黃綠色，老后顏色變暗，背面無色；顯微鏡觀察菌絲發達，有隔膜，分生孢子頭呈放射狀，頂囊近球形，如圖1-A、圖1-B所示，依據《真菌鑒定手冊》將其初步鑒定為曲霉菌。

A-菌落形態; B-顯微形態(×10)

圖1 菌株QM-6的菌落形態和顯微形態

Fig.1 Colony and microscopic morphology of strain QM-6

菌株QH-3菌落初始為白色，24 h后呈亮黃色，開始長黑色孢子，老熟后呈黑色厚絨狀，背面無色。顯微鏡觀察菌絲發達，有隔膜，囊內產生孢囊孢子，頂囊近球形，如圖2-A、圖2-B所示，依據《真菌鑒定手冊》將其初步鑒定為曲霉菌。

A-菌落形態; B-顯微形態(×10)

圖2 菌株QH-3的菌落形態和顯微形態

Fig.2 Colony and microscopic morphology of strain QH-3

2.1.3 分子鑒定與系統發育樹構建

為了明確菌株QM-6、QH-3的分類學地位和系統發育關系，對其進行ITS序列分析，并利用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。菌株QM-6、QH-3基因組DNA的ITS序列擴增電泳圖如圖3-A和圖3-B所示，PCR產物條帶明亮清晰，條帶長度約為600 bp。

A-菌株QM-6; B-菌株QH-3

圖3 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products

將測序結果與NCBI數據庫BLAST進行比對，利用MEGA 7.0軟件和Neighbor-Joining法對同源性較高的模式菌株進行系統發育分析，結果如圖4。

A-菌株QM-6; B-菌株QH-3

圖4 菌株QM-6、QH-3基于ITS序列的系統發育樹

Fig.4 Phylogenetic trees of strain QM-6 and QH-3 based on ITS gene sequence

由系統發育分析可知，菌株QM-6與AspergillusoryzaeB261同源性達99% (圖4-A)，菌株QH-3與AspergillusnigerR204同源性達99% (圖4-B)，結合菌株的形態學特征，將2株菌分別鑒定命名為米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3。

2.2 制曲過程的變化

單一菌株和復合菌株共培養制曲過程中蠶豆曲的變化結果見表2。由表2可以看出，單一米曲霉制曲，米曲霉生長較慢，第2天開始長孢子，成曲曲芯顏色較淡，曲香較濃，無不良氣味，曲料第6天開始變軟；單一黑曲霉制曲，黑曲霉生長較快，第1天開始長黑色孢子，成曲曲芯顏色較淡，曲香較單一，曲料第4天開始變軟；而米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲生長較快，第1天曲芯已經變紅，成曲曲芯顏色較深，曲香濃郁，無不良氣味，曲料第6天開始變軟。米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養制曲較單一米曲霉制曲原料利用率高、周期短，制曲第5天，成曲曲香濃郁，品質優良。結果表明，米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲能有效改善成曲風味。

2.3 單菌株及復合菌株制曲過程中酶活變化

2.3.1 蛋白酶活力變化

制曲時間直接影響微生物產酶活力以及對原料的利用率，制曲時間過短，霉菌菌絲不能完全深入到基質，導致微生物對原料的利用率降低且酶活力不高；制曲時間過長，容易感染雜菌，且孢子大量生長不利于微生物對原料的利用[24]。單菌株及復合菌株制曲產蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)活力隨時間變化如圖5A～C所示。在制曲第1天，處于孢子萌發期，菌絲大量生長，單菌和復合菌制曲蛋白酶活力均較低；第2天開始，孢子大量生長，蛋白酶活力逐漸增大。

表2 制曲過程曲料的感官變化

續表2

制曲時間/d指標菌株米曲霉QM-6黑曲霉QH-3復合制曲6菌絲/孢子布滿黃綠色孢子黑色孢子豐滿黃綠色孢子和黑色孢子均較多顏色曲芯呈乳白色曲芯呈淺黃色曲芯呈粉紅色氣味有曲香味曲香較淡,無不良異味曲香較濃質地柔軟且蓬松很軟且蓬松較柔軟蓬松7菌絲/孢子布滿黃褐色孢子黑色孢子豐滿黃綠色孢子和黑色孢子均較多顏色曲芯白色曲芯呈黃色曲芯呈粉紅色氣味曲香味較淡曲香非常淡,無不良異味曲香味較淡質地較柔軟且蓬松非常軟且蓬松柔軟蓬松

A-酸性蛋白酶; B-中性蛋白酶; C-堿性蛋白酶

圖5 制曲過程蛋白酶活性變化

Fig.5 Changes of protease activity during koji making process

單一黑曲霉QH-3產酸性蛋白酶活力增長較快，第6天酶活力達最大值1 233 U/g；單一米曲霉QM-6產酸性蛋白酶活力增長緩慢且酶活力較低，第3天酶活力最高為277 U/g；米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲酶活力在第5天達最大值為513 U/g，比單一米曲霉制曲酶活力高。

單一黑曲霉QH-3制曲前3 d幾乎不產中性蛋白酶，第4天中性蛋白酶活力開始增加，第6天開始趨于平穩，酶活力最高為400 U/g；單一米曲霉QM-6制曲、米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲初期產中性蛋白酶活力呈對數增長，單一米曲霉制曲第5天酶活力最高為1 397 U/g，之后產酶能力降低，復合制曲第5天酶活力最高為1 532 U/g，之后趨于平穩。

單一黑曲霉制曲前4 d產堿性蛋白酶活力較低，第4天開始酶活力緩慢增加，到第6天酶活力達最大值268 U/g；單一米曲霉制曲，產堿性蛋白酶活力增長較快，在第5天酶活力最高為1 090 U/g，之后酶活力降低并趨于平穩；米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲，產堿性蛋白酶活力增長較快，在第6天酶活力最高為1 164 U/g，之后趨于平穩。

由于制曲過程中蛋白質被微生物利用，產生大量氨，使pH值保持在較高水平，而米曲霉產酸性蛋白酶最適pH值為5左右，較黑曲霉低[25]，所以米曲霉單獨制曲時產酸性蛋白酶活力較低，產中性和堿性蛋白酶活力較高，黑曲霉產酸性蛋白酶活力較高，產中性和堿性蛋白酶活力較低，而研究表明，發酵醪呈酸性條件下，酸性蛋白酶對于蛋白質降解至關重要[26]。李幼筠[27]在利用滬釀3.042米曲霉純種制曲時，得到的酸性、中性和堿性蛋白酶活力分別僅為309.1、194.5和83.5 U/g，利用米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養制曲可以有效提高豆瓣成曲中蛋白酶活力，使各種蛋白酶活力更加均衡。

2.3.2 淀粉酶活力變化

淀粉酶可使原料中的淀粉糖化，為微生物生長提供碳源，并且在發酵階段繼續催化淀粉糖化形成甜味物質[28]。單一菌株及復合菌株制曲產淀粉酶活力隨時間變化如圖6所示，單一黑曲霉制曲，淀粉酶活力增長緩慢，第7天達最大值270 U/g，之后趨于平穩；單一米曲霉制曲，前7 d淀粉酶活力呈顯著上升趨勢，第7天達最大值1 026 U/g；米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲比單一黑曲霉制曲淀粉酶活力高1倍，并在第8天達最大值574 U/g，之后趨于平穩。

圖6 制曲過程淀粉酶活性變化

Fig.6 Changes of amylase activity during koji making process

2.3.3 纖維素酶活力變化

蠶豆作為生產郫縣豆瓣的主要原料，有纖維素外殼保護著，纖維素酶可以水解包在蛋白質和淀粉外的纖維素保護層，從而使物料中的有效成分被充分水解[29]。單一菌株及復合菌株制曲產纖維素酶活力隨時間變化如圖7所示。單一米曲霉制曲產纖維素酶活力增長緩慢，第4天達最大值50 U/g，之后趨于平穩；單一黑曲霉產纖維素酶活力能力比米曲霉強菌株強，在第6天酶活力最高為217 U/g，之后開始下降；米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲比單一米曲霉制曲酶活力高，在第5天酶活力達最大值121 U/g，約是單一米曲霉制曲成曲纖維素酶活力的2.5倍，之后開始下降并趨于平穩。

圖7 制曲過程CMC纖維素酶活性變化

Fig.7 Changes of cellulase (CMC) activity during koji making process

2.3.4 氨肽酶活力變化

蛋白酶水解蛋白質過程中可能產生苦味肽，氨肽酶可以從多肽鏈的N端水解氨基酸，使其變成游離的氨基酸，從而達到脫苦的目的[30]。單一菌株及復合菌株制曲產亮氨酸氨肽酶活力隨時間變化如圖8所示。單一菌株制曲和復合制曲產氨肽酶活力增長趨勢大致相同，都是先上升后降低并趨于平穩。單一黑曲霉氨肽酶活力在第4天最高為64 U/g，單一米曲霉氨肽酶活力第5天最高為128 U/g，而米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養復合制曲產氨肽酶在第5天達最大值151 U/g，比單一菌株最大氨肽酶活力高。

圖8 制曲過程亮氨酸氨肽酶活性變化

Fig.8 Changes of Leucine aminopeptidase activity during koji making process

綜合以上分析可知，單一米曲霉QM-6制曲產中性蛋白酶、堿性蛋白酶、淀粉酶和氨肽酶活力較高，產酸性蛋白酶和纖維素酶活力較弱；單一黑曲霉QH-3制曲產酸性蛋白酶和纖維素酶活力較高，產中性蛋白酶、堿性蛋白酶、淀粉酶和氨肽酶活力較低；米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養制曲產各種酶活力大小比較均衡，且都高于米曲霉或黑曲霉單獨制曲，尤其是產中性蛋白酶、堿性蛋白酶和氨肽酶活力都高于米曲霉單獨制曲，并且由于黑曲霉的協同作用，復合制曲產酸性蛋白酶和纖維素酶活力也較米曲霉單獨制曲增大了約1倍，達到了酶系互補的明顯效果。

3 結論

從傳統釀造醬制品中分離鑒定得到高產蛋白酶米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3，與單一接種米曲霉制曲相比，2株曲霉共培養能促進提高豆瓣曲中中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶以及氨肽酶的產生和酶活力，彌補米曲霉純種制曲中主要酶活力不足的缺陷，使豆瓣曲酶系組成更優，且制備的郫縣豆瓣成曲品質優良，風味濃郁。研究表明，米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培養制曲在郫縣豆瓣釀造中有很好的應用潛力。