培養條件對湛江等鞭金藻生長和油脂產率的影響

董學衛，李有志，何慶芳，于金慧，畢玉平*

1(廣西大學 生命科學與技術學院,亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧， 530004) 2(山東省農業科學院生物技術中心，山東省作物與畜禽品種改良生物技術重點實驗室，農業部黃淮海作物遺傳改良與生物技術重點開發實驗室，山東 濟南，250100) 3(美國阿肯色大學 應用科學系，美國)

微藻具備光效高，生長速度快，投入低等優點，是多種高附加值天然產物、生物活性化合物的重要來源[1]。此外，微藻可在海水、苦咸水、市政污水等非農用水中培養，減少了新鮮水消耗；也可在灘涂、鹽堿地等邊際土地上大規模培養，做到“不與人爭糧、不與人爭地”[2]。但是微藻生物量濃度低，造成收獲耗能大、新鮮水消耗多，導致微藻及其油脂生產成本高。因此，優化微藻培養條件，提高微藻的油脂產率和培養操作的靈活性，對充分開發利用湛江等鞭金藻具有重要的意義。

影響微藻生長和油脂積累的因素一般包括：光、碳源、氮磷等無機成分、營養方式等。光強對微藻生長的影響可分為光限制、光飽和及光抑制。到達光飽和之前，增強光強可以促進微藻生長[2]，但是油脂積累量不高，有利于微藻生長和油脂積累的最佳光強往往是不同的[3]。氮是組成核酸和蛋白質的主要元素，與微藻初級代謝相關[4]。充足的氮可以促進微藻生長，但缺氮條件卻有利于油脂積累[2]。微藻營養方式分為光自養、異養、兼養等，對其生長和油脂積累具有不同影響[5]。一般情況下，微藻在生長條件不利情況時能夠大量產生油脂，作為碳和能量的儲存形式[2]，但通常以較低的生物量產率為代價。油脂產率代表油脂含量和生物量綜合影響，是表征微藻油脂生產能力最合適的性能指標，為提高湛江等鞭金藻開發利用的經濟性，需要優化微藻培養條件，提高其油脂產率[6]。目前，微藻培養的操作模式已進行了廣泛研究，主要包括分批、分批補料、連續、半連續、兩步法等[5]，但這些培養操作模式均有不足之處。如兩步培養需將微藻從營養豐富培養基轉換到營養缺乏培養基，大規模培養時操作成本高；補料分批和連續培養常在營養充足條件下進行，微藻油脂/多糖含量未必高，往往導致下游加工成本更高。如果可以通過一步培養操作實現微藻培養和油脂積累的目標，可以降低生產成本，提高操作效率。

因此，本文以湛江等鞭金藻為研究對象，通過測定生長和生化組分變化，研究NaNO3濃度，光強和營養方式對生長和油脂積累的影響，并探究生長和氮消耗間的關系，以期為微藻油脂的商業化提供指導。

1 材料與方法

1.1 藻種和培養基

湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)來自山東省農科院生物技術中心藻種資源庫，藻株用人工海水改良f/2培養基培養[7]。

1.2 分批培養實驗設計

湛江等鞭金藻在500 mL的錐形瓶中培養，使用300 mL滅菌的改良f/2培養基，光周期為14∶10，日光燈管提供光照，溫度控制在(25±1) ℃，通入純空氣或含CO2的空氣。培養條件見表1。

表1 不同培養條件的特征

對于光自養培養，提供不同光強，無機碳作碳源(含2% CO2空氣流)。對于兼養培養，用葡萄糖(0.2 g/L)和無機碳(含2% CO2空氣流)作碳源；對于光異養培養，培養基中提供葡萄糖(0.2 g/L)，并添加10-6mol/L 3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲(DCMU)，持續通入空氣。所有通氣培養中，通氣比為0.2 vvm。為評估氮濃度對湛江等鞭金藻生長和油脂積累影響，以NaNO3為氮源，培養物分別接種于氮質量濃度分別為75、375和750 mg/L的改良f/2培養基中。分別選取低光強為100 μmol/(m2·s)(low light, LL)和高光強為200 μmol/(m2·s)(high light, HL)的光照，以研究光強對湛江等鞭金藻生長和油脂積累的影響。實驗過程中，每天測細胞密度和培養基中氮濃度，培養結束后測干重和各生化組分含量。

1.3 微藻生長和生化成分測定

細胞個數采用顯微鏡直接鏡檢計數。微藻在6 000×g條件下離心5 min，純化水洗滌2次，放入預干燥和稱重的培養皿中，40 ℃干燥至恒重，重量分析法測干重。總脂采用BLIGH等的方法測定[8]。多糖采用苯酚硫酸法，葡萄糖為標準物質[9]。蛋白質采用考馬斯亮藍染色法測定，以牛血清白蛋白為標準[10]。采用DONG等[11]的方法將藻類生物質直接甲酯化，氣相色譜分析脂肪酸甲酯組成。

1.4 生物量產率和油脂產率測定

生物量產率(Pbiomass)按公式(1)計算：

(1)

油脂產率(Plipid)按公式(2)計算：

(2)

1.5 氮濃度測定

通過紫外分光光度法測OD220nm[12]，由標準曲線換算成NaNO3濃度，該方法原理是人工海水主要成分在紫外域具有吸收光譜。

1.6 統計學分析

所有結果以平均值±標準偏差表示。所有數據用SPSS 10(Chicago，IL，USA)中的單向ANOVA(方差分析)和Duncan多重范圍試驗(P<0.05)進行評估。

2 結果與分析

2.1 培養條件和營養方式對湛江等鞭金藻生物量濃度影響

如圖1所示，光強分別為100和200 μmol/(m2·s)時，不同營養方式下，隨NaNO3質量濃度升高(從75 mg/L升高到750 mg/L)，微藻生物量濃度在逐步增大。培養9 d后，NaNO3質量濃度為75 mg/L、光強為100 μmol/(m2·s)光異養時生物量濃度最低為0.46 g/L，NaNO3質量濃度為750 mg/L，光強為200 μmol/(m2·s)兼養時生物量質量濃度最高為2.20 g/L。氮是合成蛋白質、核酸等生物大分子的必需元素，增加氮供應生物量濃度將增加，這與其他研究結果一致[13]，也有研究證明，氮濃度較低時會導致細胞營養不足，從而影響微藻的正常生長[4]。

在相同的光強和NaNO3質量濃度條件下，兼養培養可獲得最高的生物量濃度(0.78～2.2 g/L，平均為相同條件下光自養培養的1.34倍，光異養培養的2.28倍)，表明湛江等鞭金藻可同時利用CO2和葡萄糖2種碳源，并獲得更高產量。兼養培養具有將有機碳和無機碳同化的優勢，可將外部提供的或呼吸過程中產生的CO2進行同化[14]。特別是葡萄糖存在下，通過光合作用將有氧呼吸時釋放的CO2進行再固定被證明是兼養培養條件下生物質合成的關鍵[15]。此外，兼養培養還可以減少自養培養時的自遮蔽問題，也可以降低異養時的成本增加問題[14]，因此兼養培養(以有機碳如葡萄糖作為補充)在微藻生物質和次生代謝產物生產中被廣泛應用[16]。

在相同的NaNO3質量濃度條件下，光自養培養湛江等鞭金藻時，高光強(200 μmol/(m2·s))時生物量濃度增大，最高為1.76 g/L；光異養和兼養培養湛江等鞭金藻時，低光強(100 μmol/(m2·s))時生物量濃度高，兼養時最高為2.2 g/L，光異養時最高為0.97 g/L。光是合成ATP和NADPH所必需的因素，它驅動產生碳骨架光合作用的暗反應[4]，對微藻的生化組成和生物量有影響[17]，因此光強是微藻培養的主要限制因素之一。光強過低或過高，微藻均不能有效生長[2]。較高的光強會使光合速率逐步增加到最大點，之后逐漸降低，直到光合速率被光呼吸和光抑制平衡。本實驗結果顯示，增加光強提高了湛江等鞭金藻光自養時生物量濃度，RODOLFI等[18]在平板式光生物反應器中培養微擬球藻Nannochloropsis時也發現隨光強增加生物量產率升高的現象。LV等[19]證明與低光強和高光強相比，光強為60 μmol/(m2·s)時，小球藻C.vulgaris生物量濃度和油脂含量均升高。

圖1 不同營養方式、光強、NaNO3質量濃度對湛江等鞭金藻生物量的影響

Fig.1 Biomass production performance of I. zhanjiangensis grown on f/2 media under different trophic modes (photoautotrophic,mixotrophic and photoheterotrophic cultivation), light intensity, and NaNO3 concentrations

綜合分析以上結果可知，NaNO3質量濃度為750 mg/L、光強為100 μmol/(m2·s)、兼養培養可獲得最高生物量，因此是分批培養湛江等鞭金藻時獲得生物量的合適培養條件。

2.2 培養條件和營養方式對湛江等鞭金藻生化成分影響

不同培養條件和營養方式下湛江等鞭金藻生化成分見圖2。

圖2 不同營養方式(光自養、兼養、光異養)、光強和NaNO3質量濃度對湛江等鞭金藻生化成分的影響

Fig.2 Biochemical components of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium under different trophic modes (photoautotrophic, mixotrophic, and photoheterotrophic cultivation), light intensity, and NaNO3 concentration

在通入CO2氣體條件下(光自養和兼養)，多糖含量是30%～40%；當使用葡萄糖為唯一碳源條件下(光異養)，多糖含量稍低。與光自養相比，兼養和光異養條件下多糖含量下降，而總脂含量增加。最高多糖含量(50.8%)在NaNO3質量濃度為75 mg/L、光強為200 μmol/(m2·s)、光自養條件下獲得，最高油脂含量(46.0%)在NaNO3質量濃度為75 mg/L、光強為100 μmol/(m2·s)、光異養條件下獲得。兼養培養時油脂含量高于光自養培養。一般而言，兼養培養時，部分能量用于生長，其余能量以碳水化合物和油脂形式儲存，使得微藻細胞腫脹，體積增大，油脂含量升高[20]。碳水化合物和油脂的數值成反比，如GOODSON等[21]和LI等[16]分別在研究C.sorokiniana和Chlamydomonasreinhardtii時發現，油脂合成在很大程度上依賴于淀粉降解，因為葉綠體中淀粉較少時，可以為儲存油脂提供更多空間。

在相同的營養方式和光強下，NaNO3濃度越低，湛江等鞭金藻油脂和多糖含量越高；NaNO3濃度越高，蛋白質含量越高。缺氮培養是微藻油脂生產中應用最廣泛的營養脅迫，氮饑餓下刺激油脂積累主要包括以下兩種機制。一方面，由于大多數氨基酸合成中需要氮，所以在氮饑餓時蛋白質含量降低，并且導致細胞通常處入細胞周期的停滯期，可表達更高水平的應激標記代謝物如碳水化合物和油脂[22]。另一方面，氮饑餓條件下，微藻積累更多的油脂，也可能是將碳水化合物轉化和重新分配成脂肪，從而使油脂含量增加[23]。WASE等[24]通過基于GC-MS的代謝組學和ITRAQ標記的蛋白質組學分析發現，氮饑餓時，糖酵解、TCA循環、淀粉、油脂代謝、氮同化、氨基酸代謝和氧化磷酸化所涉及的酶增強，相反，卡爾文循環、光收獲復合體、乙醛酸循環、一碳代謝、戊糖磷酸途徑和核糖體的酶則減少。

相同營養方式下，氮濃度相同時，光強增加導致湛江等鞭金藻總脂含量降低，對綠色巴夫藻Pavlovalutheri和三角褐指藻Phaeodactylum.tricornutum研究中也發現了相同規律[25-26]。一般而言，光強升高時蛋白含量降低，而總脂和多糖含量增加[22]。微藻傾向于積聚油脂，而不是碳水化合物，因為積累油脂可以避免光損傷現象發生，同時油脂作為能量儲存比碳水化合物更有效[2]。如HO等[27]研究發現，高光強在微藻積累中性脂(TAG)或類胡蘿卜素時起刺激作用，在高光強(300 μmol/(m2·s))時，衣藻Chlamydomonassp. JSC4油脂產率為312 mg/(L·d)，油脂含量顯著高于低光強(30 μmol/(m2·s))時的油脂含量。本研究結果表明，湛江等鞭金藻在光強和NaNO3濃度升高時總脂含量降低，低氮和低光強利于促進湛江等鞭金藻總脂積累。這可能是多種壓力下導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，造成脂肪酸和TAG生物合成相關的酶發生氧化損傷，使得碳流向其他儲存組分，從而造成油脂含量降低[28]。

2.3 培養條件和NaNO3濃度對油脂產率的影響

從表2中看出，光強為200 μmol/(m2·s)條件下，油脂產率呈現先增大后降低的趨勢；光強為100 μmol/(m2·s)條件下，油脂產率逐步增大，最大油脂產率80.16 mg/(L·d)在低光強兼養時得到；但在低光強兼養培養、NaNO3質量濃度為375 mg/L時，油脂含量更高(37.40%)。綜合考慮油脂含量和最終獲得的生物量濃度，光強為100 μmol/(m2·s)、NaNO3質量濃度為375 mg/L兼養培養是湛江等鞭金藻大量培養生產油脂的最適培養條件，同時，較高的油脂含量利于下游處理，降低油脂生產成本。此外，與等鞭金藻Isochrysissp. 的37.8 mg/(L·d)[19]，小球藻Chlorellazofingiensis的 36.00 mg/(L·d)，小球藻C.vulgaris的27.0～35.0 mg/(L·d)，微擬球藻Nannochloropsisoceanica的56.91 mg/(L·d)，綠球藻Chlorococcumpamirum的41.00 mg/(L·d)，柵藻Scenedesmussp.的20.70 mg/(L·d)[29]等研究結果相比，本實驗中獲得的油脂產率更高。

注：高光強: 200 μmol/(m2·s);低光強: 100 μmol/(m2·s)

2.4 培養條件和營養方式對微藻生長和氮源消耗的影響

不同培養條件和營養方式下，細胞密度和氮消耗比較見圖3。

▲-光異養/高光強；■-兼養/高光強；?-光自養/高光強；▼-光異養/低光強；◆-兼養/低光強；□-光自養/低光強

圖3 f/2培養基中不同培養條件下湛江等鞭金藻生長動力學和相應的氮消耗

Fig.3 Growth kinetics of I. zhanjiangensis grown on f/2 medium under different cultivation conditions and corresponding nitrogen consumption

注：每個點代表3次重復的平均值。a, d分別為NaNO3質量濃度為75 mg/L時的生長和氮消耗曲線；b, e分別為NaNO3質量濃度為375 mg/L時的生長和氮消耗曲線；c, f分別為NaNO3質量濃度為750 mg/L時的生長和氮消耗曲線。

隨培養時間延長，各組細胞密度均有不同程度增加。光異養條件下生長慢，最高細胞密度僅為52×106cells/mL，兼養培養比光自養和光異養培養生長快，兼養和光自養培養9 d最大細胞密度分別可達到112 × 106cells/mL和92× 106cells/mL (圖3-a～圖3-c)。

氮為湛江等鞭金藻生長的限制因子，這在其他微藻中也已證實[30]。氮消耗曲線顯示，NaNO3質量濃度為75和375 mg/L培養基中，光自養和光異養時，氮先后在指數階段中期完全耗盡(圖3-e,圖3-f)；兼養條件下，氮源的消耗主要用于生長，產生大量微藻(圖3-d,圖3-e,圖3-f)，因此兼養的氮消耗比光自養和光異養條件下快。在氮源充足(NaNO3質量濃度為750 mg/L)時，3種營養方式下氮均沒有耗盡，但與NaNO3質量濃度為75和375 mg/L時的氮消耗特點一致，均是兼養最快，光異養消耗最慢，這也與生長曲線一致。NaNO3質量濃度為375 mg/L時，兼養方式培養湛江等鞭金藻，既可以獲得較高的生物量和油脂產率，同時氮消耗率可達90%以上，利于培養基中營養物質的充分利用。在研究其他微藻時也發現，氮濃度能夠影響氮消耗率，如GONCALVES等[31]發現小球藻C.vulgaris，月芽藻Pseudokirchneriellasubcapitata，集胞藻Synechocystissalina和銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa等微藻對氮的利用率達到近90%。

2.5 湛江等鞭金藻的脂肪酸組成

在光強為100 μmol/(m2·s)兼養條件下，不同NaNO3濃度生長的微藻培養物中主要脂肪酸組成用GC分析(表3)確定。

表3 光強為100 μmol/(m2·s)兼養培養條件下不同NaNO3質量濃度時湛江等鞭金藻的脂肪酸組成

續表3

脂肪酸ρ(NaNO3)/ (mg·L-1)75037575C18∶00.66±0.070.33±0.030.44±0.05C18∶12.14±0.701.98±0.132.64±0.65C18∶20.37±0.05**0.40±0.00**0.39±0.01ALA0.42±0.210.56±0.110.43±0.17GLA0.34±0.860.35±0.110.40±0.20C20∶526.45±3.47**24.74±0.71**22.00±5.39C22∶64.95±1.21**4.76±0.32*4.18±1.99SFA33.41±0.72*34.75±2.1236.22±3.47UFA66.59±3.24*65.25±1.3163.78±3.77MUFA34.06±4.94**34.43±2.36**36.39±5.70PUFA32.53±1.54**30.82±0.25**27.39±1.84

注：SFA表示飽和脂肪酸；UFA表示不飽和脂肪酸；MUFA表示單不飽和脂肪酸；PUFA表示多不飽和脂肪酸；每個點代表3次重復的平均值。均與質量濃度為75 mg/L的情況進行比較，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

不同NaNO3濃度條件下湛江等鞭金藻脂肪酸種類沒有明顯差異，主要脂肪酸為棕櫚油酸(palmitoleic acid，16∶1)、EPA(eicosapentaenoic acid，20∶5n3)、棕櫚酸(palmitic acid，16∶0)和肉豆蔻酸(myristic acid，14∶0)，微量組分則包括硬脂酸(stearic acid，C18∶0)，油酸(oleic acid，C18∶1)、亞油酸(linoleic acid，C18∶2)、γ-亞麻酸(γ-linolenic acid，18∶3n6，GLA)、α-亞麻酸(alpha linolenic acid，18∶3n3，ALA)和docasahexaenoic acid (22∶6n3, DHA)。

湛江等鞭金藻的脂肪酸分布與FENG等[13]報道一致，主要脂肪酸是短鏈脂肪酸(C14-C18)和多不飽和脂肪酸組分。實驗結果表明，不同NaNO3濃度培養的湛江等鞭金藻中脂肪酸分布變化具有規律性，即隨著NaNO3濃度增加，MUFA和SFA水平升高而多不飽和脂肪酸水平降低。PINCHETTI等[32]研究表明，氮饑餓時脂肪酸合成過程繼續進行，SFA和MUFA增加到最大值72.2%，而多不飽和脂肪酸減少到27.7%，這與本研究中觀察到的脂肪酸分布一致。FENG等[13]研究發現湛江等鞭金藻中多不飽和脂肪酸是DHA，最高比例為14.9%，而在本研究發現其主要的多不飽和脂肪酸是EPA，最高比例為26.45%，可作為營養制品、功能食品和化妝品的合適來源。湛江等鞭金藻脂肪酸組成與生物柴油的最佳組成(C16∶1∶C18∶1和C14∶0比例為5∶4∶1)不同，EPA和DHA組分也會影響點火質量和氧化穩定性，因此不適用于生物柴油的開發利用[33]。

3 結論

綜上所述，分批培養湛江等鞭金藻時，最高油脂含量(46.00%)在NaNO3質量濃度為75 mg/L、光強為100 μmol/(m2·s)光異養生長時得到，最高生物量濃度(2.20 g/L)在NaNO3質量濃度為750 mg/L、光強為100 μmol/(m2·s)兼養培養時獲得。綜合考慮油脂含量和生物量濃度，在光強為100 μmol/(m2·s)、NaNO3質量濃度為375 mg/L兼養培養時獲得最佳油脂產率80.06 mg/L/d，這利于油脂下游加工，降低生產成本。此外，與已經報道的其他微藻生物量和油脂產率結果相比，本實驗獲得的生物量和油脂產率更高，尤其是可提高具有商業價值的不飽和脂肪酸EPA的產量，能夠為湛江等鞭金藻的開發利用提供指導。