大腸桿菌產脂肪酶代謝通量分析

左正三,張柯,宋萍*,黃寶琪, 方心草, 黃和

1(南京北盛榮能源科技有限公司,江蘇 南京，211178) 2(南京工業大學 生物與制藥工程學院,江蘇 南京，211816) 3(南京工業大學 藥學院,江蘇 南京，211816)

脂肪酶(Lipase， EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一類特殊的酯鍵水解酶，作為生物催化劑具有底物專一性好，立體選擇性強和反應條件溫和，產品易分離等優點[1]。因此，利用脂肪酶作為催化劑進行高選擇性和高效地有機合成是當今合成化學的熱點，更因為其對環境友好和節約能源等特點，被人們稱為“綠色化學”而備受矚目?？莶輻U菌(Bacillussubtilis)脂肪酶LipA為分泌性蛋白，具有高度專一的立體選擇性，是迄今為止發現的分子量最小的脂肪酶之一，這些特點使枯草桿菌脂肪酶近年來受到關注。然而，在酶蛋白的合成表達過程中，細胞能量供應不足或產生較多有毒中間代謝產物，都會影響酶的持續高效合成[2]。因此本研究從整個代謝網絡入手，從代謝層次深入認知各種代謝物與目標產物間的關系。

代謝通量分析(metabolic flux analysis，MFA)又稱代謝流分析[3]，是一種計算流經各種代謝途徑的物質流的技術，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞代謝分支點的物質流分布，在代謝工程中占有重要地位。通過計算不同途徑或不同條件下的代謝通量分布，可以表征細胞的代謝能力[4]，發現遺傳修飾對細胞代謝狀態的影響，從而為進一步更加合理地遺傳改造提供理論依據。近年來，MFA在燃料乙醇、1，3-丙二醇、有機酸(乳酸、丁二酸等)、維生素、氨基酸(谷氨酸、賴氨酸等)和抗生素等重要發酵產品，新藥開發以及環境生物技術方面都取得重要進展。但是將MFA應用于蛋白合成過程的僅有少數研究。CALIK[5]在1999年發表了第1篇關于蛋白合成代謝通量分析的研究，考察了B.licheniformis的EMP途徑、PP途徑、TCA循環和氨基酸合成途徑等，建立了B.licheniformis的中間代謝途徑模型。SONG[6]等基于代謝流分析開發了雙階段供養策略，提高了B.subtilis脂肪酶產量。

本文通過建立代謝流量平衡模型[7]，分析了誘導前后重組大腸桿菌合成脂肪酶過程中代謝通量分布，確定影響酶合成的關鍵節點、關鍵途徑，為脂肪酶高表達和高比活發酵奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶LipA重組菌的構建

根據B.subtilis168染色體上lipA基因核酸序列，設計PCR引物lip A-up (5′-CCGGAATTCATGGCAAAGAAAGACGAACAC-3′)和lip A-down (5′- CCCAAGCTTTGCTTGTGCTTGACG-3′)，在lipA-up和lip A-down中分別引入SalⅡ和HindⅢ酶切位點。以B.subtilis168基因組為模板，PCR擴增約1 kb的lipA基因片段。PCR產物與表達載體pET22b，分別用EcoRI和HindⅢ雙酶切后進行連接反應。連接產物轉化E.coliTop10，在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上隨機挑取單菌落進行驗證，篩選轉化子。經提取質粒、酶切電泳以及PCR檢測，證明得到了含有lipA的重組質粒pET22b-lipA。重組質粒再轉化表達宿主E.coliBL21，獲得重組菌BL21- pET22b-lipA。

1.2 培養基及培養方法

種子活化：接種1環斜面活化菌株接入裝有50 mL LB培養基(LB培養基g/L:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10)的三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養12 h。

一級種子培養：將種子以5%的接種量接入250 mL裝有50 mL M9培養基(M9培養基g/L： Na2HPO4·7H2O 17.096， KH2PO43， NaCl 0.5， NH4Cl 1， MgSO40.493， CaCl20.011 1， 葡萄糖4， 自然pH)的三角瓶中， 37 ℃、200 r/min發酵6 h。

二級種子培養：將一級種子以5%的接種量接入250 mL裝有50 mL M9培養基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min發酵10 h。

5 L發酵罐培養：5 L發酵罐裝液量為3 L，將5%二級種子培養液接入含有M9培養基的發酵罐，用2 mol/L NaOH控制發酵過程pH為7.0，于37 ℃，攪拌轉速200 r/min，通氣量1.0 vvm條件下培養；待發酵液OD600達到0.6～0.8時，加終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導菌體產酶，在30 ℃條件下產酶。

1.3 分析方法

葡萄糖的測定[8]：通過SBA-40C生物傳感儀測定。

生物量的測定[9]：采用紫外分光光度計測定OD600下吸光值，去離子水做空白，并記錄數據。

脂肪酶活力測定方法[10]：以對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-nitrophenylpalmitate,pNPP)為底物的分光光度法測定脂肪酶酶活。

有機酸濃度的測定[6]：采用高效液相色譜法，色譜柱：Sepax C18(250 mm×4.6 mm， 5μm)；流動相：C:10 mmol/L磷酸(pH=2.14)；D：乙腈。檢測波長：210 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

氨基酸濃度的測定[6]：發酵液上清通過衍生化，采用高效液相色譜法，色譜柱：Sepax AA專用柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A：0.1 mol/L，pH 6.5醋酸鈉溶液(含7% 乙腈)；B：乙腈(含25% 水)。流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；柱溫：36 ℃。

菌體干重的測定[11]：取5mL發酵液，離心8 000 r/min，5 min收集菌體，用蒸餾水洗滌2～3次，離心后菌體60 ℃烘干至恒重，稱重。

蛋白含量的測定[12]：采用Bradford法測定蛋白質濃度，標準蛋白為牛血清蛋白(BSA)。

1.4 代謝通量分析方法

根據E.coli的生化反應網絡和KEGG等數據庫資源[13]，結合E.coli的生長代謝特性，建立了E.coli代謝合成脂肪酶的反應網絡(圖1)及其代謝通量平衡模型，包括主要的碳骨架代謝途徑和氨基酸生物合成途徑。在建立網絡模型時做了以下假設和簡化處理：1)細胞中的中間代謝物處于擬穩態，即瞬間濃度變化為0；2)只考慮主要中心碳代謝反應的物流平衡[14]；3)無分支點的幾個連續反應簡化為一個反應式，所有反應包括生物量合成都按照固定比例進行；4)能量供需平衡，即合成菌體與產物所需的能量和EMP、HMP及TCA循環產生的能量總數相等。E.coli中NADH和FADH2都可以通過電子傳遞鏈生成ATP[15]；5)葡萄糖進入細胞均需消耗ATP；6)脂肪酶LipA的反應方程是根據其氨基酸組成確定的[16]，蛋白質合成所需要的能量為4.306 μmol ATP/μmol氨基酸[17]，LipA的蛋白濃度通過SDS-PAGE電泳分析得到；7)在代謝過程中，由于一部分碳源用于細胞的維持、產能、CO2釋放以及分泌其它一些未知的代謝產物等，造成碳源的不平衡現象，該部分通量在代謝網絡通量的計算時，并入生物量通量(VBiomass)中，生物量反應方程根據文獻[18]建立。模型中包含的反應如表1，涉及到的簡稱如表2所示。

代謝通量分析根據代謝路徑中各反應的計量關系以及底物、產物的通量和細胞組成等確定代謝網絡的通量分布。對于胞內代謝物采用擬穩態假設：假設細胞內的中間代謝物均處于擬穩態[19]，即其整個濃度變化速率為0；對于胞外代謝產物則通過檢測發酵液中該產物的比生產速度得到。于是可以得到Av=rmet，其中A(49×50)為化學計量系數矩陣，v(49×1)為代謝通量向量，rmet為代謝物凈積累速率向量(50×1)[20]。整個代謝網絡包含49個代謝反應，其中中間代謝物為45個，則自由度為4。該代謝網絡中可測速率有5個，即葡萄糖消耗速率以及乳酸、乙酸、lipA和生物量的生成速率?？紤]到氨基酸是脂肪酶組成的重要組分可能存在胞外分泌，因此也檢測了胞外20種基本氨基酸濃度變化。由于可測定的速率大于自由度，則該體系為超定系統，可用最小二乘法求得簡單解，利用MATLAB 7.1軟件求得代謝分布。在此代謝網絡中以100 mmol/(g·DCW·h)的葡萄糖的碳摩爾量為計算基準，所有代謝通量v的單位均為mmol/(g·DCW·h)[21]。

表1 代謝模型中包含的反應

表2 代謝模型中的簡稱

圖1 重組大腸桿菌產脂肪酶LipA代謝反應網絡

Fig.1 Metabolic reaction network for LipA production in Recombinant E. coli

2 結果與討論

2.1 5 L罐中重組大腸桿菌產LipA的發酵性能研究

在發酵過程中(圖2)，菌體沒有明顯延遲期，在0～4 h葡萄糖的消耗速率一直維持在0.46 g/(L·h)。3 h時，OD600達到0.6～0.8，加入誘導劑IPTG進行誘導產酶，此時葡萄糖的消耗速率開始降低，可能是由于IPTG的毒性造成的。加入誘導劑后，E.coli開始大量產酶，5 h時比活達到最高值18.11 U/mg。隨著發酵的進行，脂肪酶比活開始降低，8 h時比活降至14.14 U/mg。

圖2 E.coli在5 L罐中發酵產酶曲線

Fig.2 Enzyme production curve of E.coli fermentation in 5 L fermenter

采用SDS-PAGE對菌體胞內蛋白進行分析，結果如圖3所示。LipA脂肪酶的分子質量為19.1 kDa。1～3 h時，在14.3～20.1 kDa之間無特征條帶出現，說明未誘導時宿主菌E.coliBL21不產LipA。發酵3 h加入誘導劑后，LipA開始表達。隨著誘導時間的延長，LipA的表達量在7 h時達到最大(LipA占總蛋白含量為3%)，然而到了9 h時各組分蛋白條帶不清晰且LipA無條帶。可能是因為在對數后期和平穩期時細胞內蛋白酶的積累，分解了總蛋白，因此導致了包含脂肪酶在內的蛋白含量的下降[24]。

M-protein marker；1～9-E. coli BL21 pET2 2b-lipA 1～9 h發酵粗酶液

圖3 重組大腸桿菌誘導產脂肪酶的SDS-PAGE分析圖

Fig.3 SDS-PAGE analysis of LipA production induced by recombinant E. coli

2.2 誘導對有機酸及氨基酸的影響

發酵液中有機酸和氨基酸等雜酸含量是微生物發酵過程的另一個重要指標，通過對其分析，能夠從另一個角度更加全面的了解微生物的發酵過程?？梢詸z測到的副產物如圖4，圖5所示。通過與20種基本氨基酸標品色譜圖對照，顯示發酵液能檢測到精氨酸(Arg)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)共4種氨基酸。氨基酸濃度的變化隨著發酵的進行呈現上下波動的趨勢。其中，濃度最高的是纈氨酸，最高濃度達到22 mmol/L。其他氨基酸的濃度都基本在5 mmol/L以下。分析為氨基酸在發酵過程中不斷生成又不斷消耗造成的，并且在發酵中后期，可能由于營養物質匱乏，纈氨酸被用作為氮源促進菌體生長[26]，所以在6 h時纈氨酸濃度會降低。同時發酵中后期，由于呼吸作用細胞內的ROS會積累，過量的ROS會對菌體造成損傷[28]。亮氨酸和脯氨酸具有抵御胞內ROS的作用，菌體分泌亮氨酸和脯氨酸防止ROS對菌體造成損傷[27]，可能因此造成了亮氨酸和脯氨酸濃度增加。此外，本研究還測定了發酵液中的12種有機酸，然而在培養基中只檢測到了乳酸(Lac)。乳酸在發酵前期濃度較低，3 h時濃度為0.33 mmol/L，在4 h時達到最大濃度5.10 mmol/L，5 h時濃度開始降低至0.27 mmol/L，在發酵末期9 h時乳酸濃度又回升至2.26 mmol/L。圖2可以看出，在4 h時，菌體生物量已經達到較高水平且增長變緩，溶氧下降，因此導致乳酸濃度升高。但是隨著發酵的進行，碳源也被迅速消耗，導致生成的乳酸被用作成碳源維持細胞生長[25]，所以乳酸濃度出現了降低。而發酵末期，發酵液溶氧效果差，細胞進行無氧呼吸，又導致了乳酸的增加。至于是否IPTG誘導導致乳酸在誘導前后出現較大變化還有待進一步研究。

圖4 LipA發酵過程中有機酸濃度曲線

Fig.4 Concentration curve of organic acid produced byE.coli f in LipA fermentation

圖5 LipA發酵過程中氨基酸濃度曲線

Fig.5 Concentration curve of amino acid produced byE.coli in LipA fermentation

2.3 誘導對代謝流遷移的影響

對誘導前1 h(發酵時間2 h)和誘導后1 h(發酵時間4 h)的數據進行代謝通量分析。在3 h時，重組大腸桿菌開始誘導產酶，此時細胞內的代謝流量分布開始發生顯著變化，因此對誘導前后時間點進行代謝流分析，如圖6所示。

圖6 誘導前后的代謝通量分布圖

Fig.6 Distribution of metabolic flux before and after induction

注：反應方程編號:發酵2 h代謝通量/發酵4 h代謝通量

乳酸合成途徑(r19)的代謝通量在誘導前后變化最為明顯。經誘導產酶后，r19代謝通量由0顯著增加至137.09，碳流通過EMP途徑生成乳酸，分流了部分合成生物量的碳流，降低了生物量合成的速率，造成這種現象的原因是指數生長后期，菌體大量生長，發酵體系中的溶氧不能滿足菌體生長的要求，部分菌體進行無氧呼吸，導致乳酸途徑的通量增加。這與圖2中OD600的變化速率相符。本研究也與SONG等的研究相符，SONG等指出在指數生長期提供較高的溶氧，有利于脂肪酶的合成[6]。在組成脂肪酶的181個氨基酸中，亮氨酸占比10.4%，纈氨酸占4.9%，脯氨酸占比2.2%，精氨酸占比3.3%，亮氨酸和纈氨酸占比相對較高，且從圖6代謝通量圖中可以看出，纈氨酸代謝通量(r36)由0增加至60.68，而脯氨酸(r41)、精氨酸(r39)、亮氨酸(r35)代謝通量無變化。纈氨酸的通量的增加可能是由于該時刻脂肪酶大量合成，對纈氨酸的需求增加所致。同時代謝通量分析的數據也解釋了6 h時纈氨酸濃度出現下降的原因，消耗的纈氨酸可能被用于脂肪酶合成。但是代謝通量的數據并不能解釋胞內亮氨酸和脯氨酸在發酵6 h后出現增加。推測可能在發酵中后期，由于有氧呼吸作用造成細胞內的ROS的積累，過量的ROS會對菌體造成損傷[28]。亮氨酸和脯氨酸具有抵御胞內ROS的作用，菌體分泌亮氨酸和脯氨酸防止ROS對菌體造成損傷[27]，因此可能會造成了亮氨酸和脯氨酸濃度增加。

誘導后，磷酸戊糖途徑、TCA循環和ATP合成的通量出現了下降。磷酸戊糖途徑中的R5P(r7)通量下降了43.4%，造成誘導生物量積累速度減緩。作為能量供應環節的TCA循環通量(r11-r15)和ATP合成通量(r43-r46)降低明顯。酶蛋白的表達和折疊需要ATP作為能供應[22-23]，誘導后ATP供應不足，可能是E.coli中不能高效表達脂肪酶的一個原因。

3 結論

通過對E.coli產脂肪酶的發酵特性研究，發現在誘導2 h后(發酵時間5h)胞內脂肪酶比活達到最高18.11 U/mg。通過建立重組E.coli產脂肪酶LipA的代謝網絡模型，分析誘導前后的代謝流遷移發現，經誘導產酶后，乳酸代謝通量增加，碳流通過EMP途徑生成乳酸，分流了部分合成生物量的碳流，降低了生物量合成的速率；纈氨酸通量的增加滿足了脂肪酶的合成需求；ATP通量的減少限制了脂肪酶的高效合成。因此乳酸和ATP是E.coli合成脂肪酶合成的關鍵節點。本研究為提高生產脂肪酶菌種的發酵條件優化和代謝途徑改造提供了理論依據。