采用RT-PCR方法診斷豬繁殖與呼吸綜合征

呂娜娜 （山東畜牧獸醫職業學院寵物科技系 山東 濰坊 261061）

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采用RT-PCR方法診斷豬繁殖與呼吸綜合征

呂娜娜 （山東畜牧獸醫職業學院寵物科技系 山東 濰坊 261061）

山東某豬場發生以豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)為主要特征的疾病。筆者對送檢的病料進行了實驗室診斷：剖檢主要發現肺水腫，出血；組織病理學檢測主要發現肺間質明顯增寬，腎小管上皮腫脹；采用RT-PCR檢測方法檢測豬肺臟組織，結果被驗樣品在400bp擴增帶為PRRSV陽性，陰性對照無擴增帶出現。診斷結果表明：該豬場發生的病例為豬繁殖呼吸障礙綜合征。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱藍耳病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種有高度傳染性的豬綜合征。目前根據基因序列和抗原特性的不同，PRRSV可劃分為I型(原歐洲型，代表毒株為Lelystad virus株)和II型(原美洲型，代表毒株為ATCCVR-2332株)。1987年最早發現于美國(Zeman等，1993)，1994~1995年從美國引種傳入我國。1996年我國郭寶清等第一次分離出該病毒(郭寶清等，1996)。2001~2002年發生跨省區流行；由南向北擴散、蔓延、由華東、華南、華北、東北等10個省市(縣) 發病。2006年5月下旬起，以高熱病為特征的藍耳病，首先在南方省市發病，同年11月至12 月延伸到東北地區，全國共有19個省市(縣)出現疫情(林榮泉，2007)。2008年，我國將高致病性藍耳病列為一類動物疫病，并進行強制免疫。在自然流行中，PRRS僅見于豬，其他家畜和動物未見發病。不同年齡、品種、性別的豬均可被感染，生長豬和育肥豬感染后癥狀比較溫和，母豬和仔豬的癥狀則較為嚴重。PRRS主要經呼吸道感染，也可垂直傳播。將感染豬特別是隱性感染豬引入易感豬群是該病流行的重要原因。本病傳染性強、傳播快，發病率和死亡率高，且在豬群內持續性感染不易清除，多呈散發、點狀分布的地方性流行。

1 材料與方法

1.1 發病情況

山東某豬場養的60頭仔豬中，其中有30頭相繼發病，有6頭已死亡。發病的仔豬表現為：精神沉郁，咳嗽、打噴嚏；在豬圈內扎堆；食欲減弱，有的甚至廢絕，部分豬排灰色稀便；耳朵和嘴尖發紺，行走不穩；并伴有嘔吐，體溫升高現象。雖采用了抗生素治療，但效果不明顯，造成比較嚴重的經濟損失。

1.2 主要的儀器和試劑

BMJ-1生物組織包埋機，AO-8250型組織切片機，OLYMPUS-BHS顯微鏡，PCR擴增儀，RT-PCR檢測試劑盒。

1.3 病理學檢測

1.3.1 大體剖檢 對送檢的病死仔豬進行了尸體剖檢及大體病變的觀察。

1.3.2 病理組織學檢查 取病變明顯的組織(肝臟、腎、心和肺臟)各一小塊于10%的福爾馬林溶液中進行固定，然后經常規石蠟切片制作、HE染色。在OLYMPUS-BHS顯微鏡下觀察并照相。

1.4 RT-PCR的方法

1.4.1 RT-PCR檢測試劑盒組成 變性液(A液)，硫酸鈉溶液(B液)，酚/氯仿/異戊醇混合液(C液)，異丙醇(D液)，75%乙醇(E)，處理的滅菌去離子水(F液)，酶抑制劑(G液)，反轉錄反應液(H液)，反轉錄酶(I液)，PCR反應液(J 液)，TaqDNA聚合酶(K液)，礦物油(L液)，50倍TAE電泳緩沖液(M液)，溴化乙錠溶液(N液)，上樣緩沖液(O液)。

1.4.2 組織樣品處理 取待檢組織充分研磨，加入PBS(pH7.2)研磨成勻漿，8000r/min 5min，取上清100μl 再加入A液，混勻。取血清100μl，置滅菌離心管中，加入A液，混勻。

1.4.3 病毒RNA的提取 （1）取已處理的樣品，每管依次加入B液30μl，C液30μl、C液300μl(顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃12000r/min，離心15min。（2）取300μl上清液，置于經DEPC水處理過的1.5ml滅菌離心管中，加入300μl D液，混勻，置-70℃冰箱中30min。室溫融化，4℃，15000 r/min，20min。（3）棄上清，沿管壁緩緩滴入1mlE液，輕輕旋轉一周后打掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，氮空抽干16min(以無水乙醇為準)。（4）按9:1比例配制F:G混合液，每個樣品用用10μl F:G混合液溶解，﹣20℃儲存備用。

1.4.4 反轉錄(RT)操作 每份總體積20μl 。取16μl H液(用前混勻)、1μl G液、1μl I液、2μl 已溶解的病毒RNA?；靹虿⒆龊霉P記，在PCR擴增儀上進行以下循環：42℃60min，98℃5min。

1.4.5 PCR操作 每份總體積20μl。取16μl J液(用前混勻)、2μl K液、1μl I液、2μl 1.4.4中的反轉錄產物。混勻，做好標記并加入L液20μl覆蓋，放于PCR擴增儀上，擴增條件為94℃30s，55℃30s，72℃30s。35個循環后，72℃延伸5 min。

1.4.6 電泳 稱4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中，加入50倍稀釋的M液200ml(取4mlM液，用雙蒸水稀釋至200ml)，于微波爐中溶解，再加入20μl N液混勻。在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴增物15μl混合3μlO液，點樣與瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于50倍稀釋的M液中電泳，紫外燈下觀察結果。

2 結果

2.1 剖檢病變

剖檢病死仔豬，主要病變為身體皮膚散在出血點，耳尖發紺；肺臟明顯出血，水腫，眼睛有分泌物；胃大彎淤血，小彎淤血；附睪淤血；腸系膜淤血。

2.2 病理組織學變化

肺間質明顯增寬，肺間質疏松(圖1)。腎小管上皮腫脹，腎小球毛細血管內皮腫脹(圖2)。

圖1 肺間質明顯增寬

圖2 腎小管上皮腫脹, 腎小球毛細血管內皮腫脹

2.3 RT-PCR檢測結果

被驗樣品、陽性對照出現400bp擴增帶，陰性對照無擴增帶出現。

3 討論

3.1 病例的確診

通過體表觀察到豬耳尖發紺，剖檢發現病死仔肺臟明顯出血，水腫，符合豬繁殖呼吸障礙綜合征的典型癥狀；組織病理學檢測可見肺間質明顯增寬，腎小管上皮細胞腫脹；RT-PCR擴增出豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)400bp擴增帶。因此綜合以上診斷結果表明該豬場發生了豬繁殖呼吸障礙綜合征。

3.2 檢測技術

PRRS的診斷方法有許多種，病毒的分離鑒定、血清學診斷方法和分子生物學診斷方法等方法及技術。其中，血清學診斷方法有免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IMPA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELASA)和血清中和試驗(SNT)等，但由于PRRSV 的抗原型差異，一種方法只有使用2種抗原亞型才能檢出I型、II型的抗原或抗體，因此血清學方法只能用于評價豬群PRRSV感染狀況，不能進行確診。以分子病毒學為基礎的單克隆抗體技術、核酸探針雜交技術和RT-PCR技術特異性高、準確且操作簡便而被廣泛應用(王蘭平，2007)，此外還有一些快速的PRRS檢測方法，如脂質體免疫測定法(LIA )、高通量疾病基因篩查工具，納米金標技術等。

3.3 綜合防治

本病目前尚無特效藥物療法，主要采取綜合防治措施及對癥療法。最根本的方法是消除病豬、帶毒豬和徹底消毒，切斷傳播途徑。此外應加強進口豬的檢疫和本病的檢測，以防本病擴散。因此在這種情況下需要建立有效的管理策略，嚴格執行消毒制度，實行全進全出制，加強生物安全措施，做好豬群飼養管理，定期對豬群中豬群PRRSV感染情況進行檢測，對發病豬場要嚴密封鎖，根據地域情況和豬場特點選擇合適的疫苗種類進行免疫接種，增強豬體特異性抗病力(于洪鎮，2011)，同時控制好應激及其他疾病的感染。

[1] 郭寶清, 陳章水, 劉文興等. 從疑似PRRS 流產胎兒分離PRRSV的研究[J]. 中國畜禽傳染病, 1996, 87(2): 124.

[2] 林榮泉. 探討高致病性豬藍耳病檢疫檢驗與防控[J]. 肉類工業, 2007(9): 38-40.

[3] 王蘭平. 豬繁殖于呼吸綜合征檢測技術綜述[J]. 中國動物檢疫, 2007, 24(8): 46-47.

[4] 于洪震. 高致病性藍耳病的發病特點和防治[J]. 山東畜牧獸醫, 2011, 32: 26.

[5] Zeman D, Neiger R, Nelson E, et a1. Mine hart M Laboratory investigation of PRRS virus infection in three swine herds. J Vet Diagn Invest.1993, 5(4):52-2528.

（2018–07–02）

S854.4+3

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