不同佐劑制備雞新城疫、禽流感二聯滅活苗免疫效果評價試驗

劉曉婧 叢雁方 魏波 王宏華 王艷玲 蔣貽海* 袁延文 張春革 （青島蔚藍生物制品有限公司 山東 青島 青島動保國家工程技術研究中心有限公司 山東 青島 青島蔚藍生物股份有限公司 山東 青島 山東省壽光市畜牧獸醫管理局 通標標準技術服務有限公司青島分公司 山東 青島）

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不同佐劑制備雞新城疫、禽流感二聯滅活苗免疫效果評價試驗

劉曉婧①叢雁方②魏波②王宏華③王艷玲②③蔣貽海③*袁延文④張春革⑤（①青島蔚藍生物制品有限公司 山東 青島 ②青島動保國家工程技術研究中心有限公司 山東 青島 ③青島蔚藍生物股份有限公司 山東 青島 ④山東省壽光市畜牧獸醫管理局 ⑤通標標準技術服務有限公司青島分公司 山東 青島）

基于對市場現有佐劑產品的了解取不同佐劑產品作比較，以禽類疫苗為例。選取雞新城疫、禽流感(H9亞型)二聯滅活苗(Lasota株+WD株)滅活后抗原液，按不同佐劑的配苗比例分別配制滅活苗，驗證其免疫效果。將添加不同佐劑配制的滅活苗分別免疫7日齡商品肉雞，分6組，每組30只，其中1~5組分別免疫5種不同佐劑配制的禽流感滅活疫苗，6組為空白對照，各免疫0.3ml/只。分別于免疫后14、21、28、35d采血，離心后取血清，利用血凝抑制方法分別檢測雞新城疫和H9亞型禽流感血清抗體。計算抗體平均滴度。試驗結果顯示，MF59、GEL02和ISA70VG等新型佐劑較傳統佐劑均能產生較高的抗體水平且能使機體在短期內快速產生免疫應答反應并能很好的維持其抗體水平。

滅活苗 佐劑 免疫效果

雞新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種急性高度接觸性傳染病，其發病率和死亡率極高[1]。禽流感(AI)則是由A型流感病毒(AIV)引起，主要通過呼吸系統傳播的嚴重侵害禽類呼吸系統和生殖系統的一種傳染病[2,3]。在我國新城疫和禽流感等疫病的暴發對養禽業造成了巨大的經濟損失，均屬于必須要防控的重要疫病。

目前，雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯滅活疫苗(Lasota株+WD株)多數采用白油作為佐劑[4,5]，但隨著科技的發展，越來越多的佐劑種類出現，現已提出了許多新的作用機制。選擇合適的佐劑可促進機體產生特異的免疫應答反應：提高抗原吸收率、延長抗原儲備時間、激活補體活性、促進相關細胞因子釋放、將抗原提呈給不同的APC群、調節MHCI型和II型抗原分子表達和刺激抗體產生。為更好地了解不同佐劑制備的雞新城疫、流感(H9亞型)二聯滅活疫苗在雞群的免疫效果，我們從市場上選取5種禽類疫苗用佐劑，分別配制二聯苗，開展了田間雞新城疫、流感(H9亞型)二聯滅活疫苗免疫效果的評估工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 肉仔雞180只。在選定的養殖場根據常規方法養殖。

1.1.2 試驗滅活抗原 雞新城疫病毒(Lasota株)、H9亞型禽流感病毒(WD株)二聯滅活抗原液：青島蔚藍生物制品有限公司生產。

1.1.3 檢測試劑 雞新城疫HI實驗標準抗原和陽性血清均購自中國獸醫藥品監察所。H9亞型禽流感HI標準抗原和陽性血清均購自哈爾濱維科生物技術開發公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備 先將經檢測合格的新城疫病毒液和禽流感(H9亞型)滅活病毒液按配苗比例混合，再將混合后的病毒液與佐劑按照其參考劑量制備滅活苗，共制備5種二聯滅活苗。

1.2.2 安全檢驗 根據《中華人民共和國獸藥典》附錄中的檢測方法進行檢驗。每組疫苗10只，每只頸部皮下注射疫苗0.1ml，觀察14日內是否出現因疫苗引起的局部和全身性不良反應[6]。

1.2.3 免疫程序 5種滅活苗分別于肉仔雞7日齡免疫，劑量0.3ml/羽。不同佐劑制備的二聯滅活苗分組情況如表1。

表1 實驗分組情況

1.2.4 抗體測定 分別于7日齡免疫前，免疫后14、21、28和35d，每組采集30份雞血清分別測定其抗體效價。

1.2.5 HI抗體效價測定 按照《中華人民共和國獸藥典》附錄中血凝抑制標準檢測方法[6]，分別測定ND和AI(H9亞型)抗體水平，記錄實驗結果。

1.2.6 數據整理和分析 對檢測結果用Excel、SPSS20.0等軟件，進行數據整理、統計分析。HI效價≥4log2判定為合格。

2 結果

2.1 疫苗檢驗

疫苗檢驗結果詳見表2。由表2可見，各滅活苗的安全檢驗均符合國家標準。雞群精神狀態良好，采食正常；注射部位未見肉芽組織形成，疫苗吸收良好，機體未產生過敏反應和局部不良反應。

表2 不同佐劑制備的雞新城疫和禽流感(H9亞型)二聯滅活苗安全檢驗

2.2 抗體檢測情況

7日齡肉仔雞的抗新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的母源HI抗體效價幾何平均值分別為6.6log2和7.3log2。免疫后雞群抗ND和AI的抗體水平詳見表3和表4。

表3 實驗動物抗新城疫HI滴度測定情況 (nlog2)

注：表中數值均為HI滴度幾何平均值。

表4 實驗動物抗禽流感H9亞型HI滴度測定情況 (nlog2)

注：表中數值均為HI滴度幾何平均值。

2.2 免疫效果監測情況

比較分析雞群抗新城疫病毒和H9亞型禽流感病毒的HI抗體水平結果，分別見圖1、圖2。

圖1 6組雞抗新城疫病毒HI抗體滴度變化

（1）由圖1可知，雞群中抗新城疫抗體5組最高，免疫后14d抗體水平均達到合格標準。免疫后28d抗體水平均達到最高值，其中4組和5組效果最好。免疫后35d抗體效價均開始下降但4組較其他疫苗組抗體水平維持期較長，抗體衰減平緩。5組的抗體水平較其他疫苗組在免疫后21d能很快達到較高的抗體水平。1組較其他疫苗組抗體水平明顯較低，但仍能達到疫苗保護的國家標準。（2）由圖2可知，雞群中抗H9亞型禽流感病毒的抗體在免疫后14d均能達到合格標準，其中2組和5組在免疫后28d抗體水平達到最高值。免疫后35d各疫苗組抗體水平均有下降，但5組表現出良好的穩定性，雞群中的抗體水平較其他疫苗組仍維持較高水平。其中，1組仍能達到疫苗的國家標準，但較其他疫苗組抗體水平明顯較低。

圖2 6組雞抗H9亞型禽流感病毒HI抗體滴度變化

3 討論與結論

（1）理想的疫苗應生產成本低、易于運輸和保存且易于應用、無毒性反應，能誘導良好的體液免疫，或能誘導良好的細胞介導免疫和黏膜免疫。鋁膠和石蠟油佐劑依舊是目前市場應用廣泛的免疫佐劑，而滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，因其抗體滴度維持時間較長，通常使用礦物油佐劑[7,8]。但是，不同佐劑對疫苗免疫效果的增強作用存在差異[9]，市場上有許多新型的佐劑，其便于應用，免疫效果更佳。雞新城疫、流感二聯滅活苗是目前市場廣泛應用的禽類疫苗，故我們選取5種佐劑與雞新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒抗原液按佐劑推薦使用劑量制備出五組二聯滅活苗，針對市場上的商品雞進行免疫效果評價。（2）本研究旨在通過對雞群免疫后HI抗體的效價來評價目前市場上的多種免疫佐劑的使用效果。試驗表明，選取的五種佐劑所制備的二聯滅活疫苗均能夠刺激機體產生良好的免疫應答反應，抵御病毒攻擊，具有較好的免疫保護效果，同時無免疫副反應，疫苗安全有效。（3）本試驗發現，7日齡(首免日齡)肉雞針對新城疫病毒和H9亞型流感病毒的母源抗體效價均較高，免疫后其抗體效價均急劇下降，其原因可能是疫苗抗原與母源抗體中和，因而造成疫苗對雞群免疫保護的真空期[10]。為盡量減少或避免母源抗體影響，建議定期檢測雛雞母源抗體，根據雛雞體內母源抗體水平確定首免時間，優化免疫程序。（4）本研究以田間試驗方式，對常規養殖的肉雞180只，按照預定的免疫程序進行免疫，定期采集血清測定抗體效價，評估該疫苗的免疫效果。試驗結果顯示，第5組添加MF59佐劑的綜合表現最好，刺激機體產生抗體較快，免疫后14d即可達到保護水平且最終達到的抗體水平最高，抗體持續時間較長。使用ISA 70 VG佐劑和GEL02佐劑的二聯苗免疫效果也很好，使用ISA70VG佐劑雖在免疫后14d抗體水平達不到4log2，但后期刺激機體產生的抗體水平較高持續時間較長；而使用GEL 02佐劑二聯苗的雞群抗新城疫病毒效果較好，抗H9亞型禽流感病毒的HI在免疫后35d下降較快，抗體水平維持時間較短。總體來說，選用的幾種佐劑配制的二聯苗均能達到免疫保護效果，其中MF59更為突出，即使用納米粘膜佐劑的疫苗抗體水平維持時間較長。新型佐劑的作用機理和應用效果還需在養殖場進行進一步驗證。

[1] 蔡寶祥. 家畜傳染病學[M]. 北京. 中國農業出版社, 1980: 352.

[2]甘孟侯. 禽流感(第2版)[M]. 北京: 中國農業出版社, 2002.

[3] 戚中田. 禽流感病毒與人類禽流感[J]. 中國科學基金, 2004, 2: 68-71.

[4] 王學艷. NDV分離株F及HN基因的遺傳變異分析與核酸疫苗質粒的構建[D]. 西北農林科技大學: 西安, 2008.

[5] 李呈軍. 中國 H9N2 亞型禽流感病毒進化分析與 H5N1亞型禽流感病毒標記疫苗的研究[D]. 中國農業科學院: 北京, 2005.

[6] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典[M]. 北京: 中國農業出版社, 2011.

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（2018–09–18）

青島“人才特區”人才項目, 新型禽流感納米黏膜佐劑疫苗的開發

S851.3

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1007-1733(2019)01-0008-03