信鴿糞便樣品中四種常見病原的檢測與分析

王樂 蔣智宇 朱建國 張孟濤 余磊 孫淑紅* （齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100 山東農業大學 山東 泰安）

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信鴿糞便樣品中四種常見病原的檢測與分析

王樂①?蔣智宇②?朱建國②張孟濤②余磊②孫淑紅②*（①齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100 ②山東農業大學 山東 泰安）

為評估某大型信鴿飼養場信鴿的健康風險，本研究對新城疫病毒(NDV)、H9流感病毒(AIV-H9)、沙門氏菌和大腸桿菌等四種信鴿常發病原進行了檢測，并對其常用敏感藥物的使用現狀評估。從樣本總量為15000只左右的某信鴿群隨機采集56份新鮮糞樣，對沙門氏菌、大腸桿菌進行分離鑒定，取4份用K-B法檢測常用藥物耐藥情況；隨機取24份糞便樣品分別提取RNA，用針對NDVHN和F基因2對引物、AIV-H9的1對引物分別進行RT-PCR檢測NDV和AIV攜帶情況。結果表明，NDV和AIV-H9的RT-PCR檢測結果顯示均為陰性(0/24、0/24)；沙門氏菌檢測為陰性(0/56)，大腸桿菌檢測陽性率為71.42%(40/56)；4份大腸桿菌陽性的糞樣藥敏試驗結果顯示為頭孢西丁、頭孢他啶敏感，本研究對該信鴿群的養殖健康以及合理用藥等方面有一定的指導意義。

信鴿大腸桿菌 沙門氏菌新城疫病毒(NDV) H9流感病毒(AIV-H9)

信鴿也稱“通信鴿”，經由普通鴿子馴化，然后提取其優越性能并加以利用和培育而產生。人們利用信鴿天生的歸巢本能，可用來傳遞緊要信息；現在信鴿的主要用途是比賽，即稱為“賽鴿”，由于賽鴿具有一定的可觀賞性以及在比賽過程中可以獲得經濟效益，近些年出現了許多賽鴿養殖場，用于培育、飼養、訓練賽鴿，以求得在比賽過程中獲得優異成績，并選育出可用于繁殖后代的優質種鴿。顯然，健康優秀的信鴿是比賽獲得名次的必要條件，本研究擬通過對信鴿糞便樣品中的四種常見病原的檢測[1]以及對常用藥物敏感試驗的測定，初步評估該信鴿群健康風險[2]，并為養殖信鴿過程中的抗生素使用提供參考。該研究對信鴿養殖業的健康發展具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 某規模化信鴿場，存養15000羽信鴿，用無RNA酶的離心管采集56份新鮮糞便樣品。

1.1.2 試驗材料 質控大腸桿菌(菌株編號為ATCC25922)，腸炎沙門菌(菌株編號CVCC3377)由山東農業大學家禽疫病防控研究室保存；沙門菌顯色培養基(上海欣中生物工程有限公司)；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(北京陸橋技術股份有限公司)；RNA isolater(Vazyme Bio)；50×TAE buffer：242gTris，57.1ml冰醋酸、100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加雙蒸水定容至1000ml，工作濃度為1×TAE；TAE緩沖液：取20ml50×TAE，加水定容至1000ml；DL2000DNA Maker(寶生物(大連)有限公司)；LB培養基：細菌培養用胰化蛋白胨10g(Bacto-teyptone)(OXOID公司)、細菌培養用酵母提取物5g(Bacto-yeast extract)(OXOID公司)、NaCl 10g，瓊脂粉(Solarbio)15g，1000ml去離水；緩沖蛋白胨水(青島高科園海博生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 用滅菌棉簽挑取信鴿新鮮糞便樣品(每5只信鴿的糞樣作為一個樣本)，放入無RNA酶的2ml離心管中，用含有冰袋的泡沫盒6h內運回實驗室。

1.2.2 樣品的處理和保存 每份糞便樣品分為兩部分，其一加入適量RNase-free水稀釋，用于RNA提取；其二用于沙門菌和大腸桿菌的分離鑒定。56份(編號1~56)糞便樣品分別用于沙門菌和大腸桿菌分離鑒定以及藥敏試驗；隨機取24份(編號1~24)加入少許RNase-free水，震蕩混勻后先-20℃環境放置30min，然后轉移到-80℃保存，提取RNA，然后用于NDV、AIV的RT-PCR檢測。

1.2.3 樣品中沙門氏菌、大腸桿菌的分離鑒定 本方法以GB 4789.4-2016國標為基礎，經本實驗室改進后對沙門氏菌、大腸桿菌進行分離鑒定，并用PCR方法重復檢測2次，保證在檢測過程的準確性和靈敏性。其中，顯色培養基使用說明可知，大腸桿菌在平板上表現為藍色，沙門氏菌變現為紫色。可疑菌落的PCR驗證：根據GenBank公布的沙門氏菌、大腸桿菌保守區域的基因序列，用Primer5.0軟件設計引物FimW、E-jiand。引物由上海生物工程技術有限公司合成(見表1)；PCR陽性的菌落再次劃板純化培養20~24h，然后再次挑取可疑菌落進行PCR重復驗證。

瓊脂凝膠糖電泳：吸取5μl保存的PCR產物，注入1%瓊脂糖凝膠，以120V電壓進行電泳檢測，并加入DNA分子量標志(DNA maker)以輔助判讀DNA樣品。50min電泳結束后，如大腸桿菌E-jiand引物所合成的目的基因在622bp左右，則視為大腸桿菌陽性；如沙門氏菌FimW引物所合成的目的基因在495bp左右，則視為沙門氏菌陽性。

表1 沙門菌FimW和大腸桿菌E-jiand鑒定引物信息

①將紫色可疑菌落用沙門氏菌FimW引物進行PCR驗證，將藍色可疑菌落用大腸桿菌E-jiand-F/R引物進行PCR驗證；②FimW引物檢測沙門菌的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、以可疑菌落為模板(忽略不計)、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃ 4min(預變性)，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共25個循環， 72℃ 10min(延伸)，4℃結束；③E-jiand-F/R引物檢測大腸桿菌的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、以可疑菌落為模板(忽略不計)、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃預變性7min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，72℃延伸10min，4℃結束。

1.2.4 大腸桿菌陽性陽性的藥物敏感試驗 使用K-B法檢測9種常用抗菌藥物的敏感性。抗菌藥物包括：諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、環丙沙星、氯霉素、頭孢西丁、頭孢他啶、慶大霉素、多粘菌素B等。

1.2.5 檢測糞便 樣品中NDV、AIV-H9的RT-PCR檢測糞便樣品總RNA提取及總RNA濃度的測定及質量檢測：采用試劑盒分別提取樣品總RNA，用Nanodrop ND-1000測定RNA樣品質量和濃度，記錄OD260/OD280，OD260 /OD230的值，兩個值均在1.8~2.0范圍內，表明提取的RNA純度較高。反轉錄：本研究參照Roche反轉錄試劑盒操作進行，用20μl體系，最終將RNA反轉錄為cDNA，并-20℃保存。具體操作方法見表2。

表2 反轉錄體系 (μl)

RT-PCR檢測糞便樣品中NDV、AIV-H9：引物設計根據GenBank公布的NDV保守區域的基因序列，用Primer5.0軟件設計引物NDV(HN-S、HN-F)與AIV-H9保守區域的基因序列，用Primer5.0軟件設計引物AIV-H9，由上海生物工程技術有限公司合成(見下表3)。

表3 NDV(HN-S、HN-F)、AIV-H9引物相關信息

③HN-S/ HN-F引物檢測NDV的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、cDNA模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 10.5μl；程序94℃ 5min(預變性)，94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，共30個循環，72℃ 10min(延伸)，4℃結束；④AIV-H9引物檢測流感病毒的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、cDNA模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃預變性5min，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30個循環，72℃延伸10min，4℃結束。

瓊脂凝膠糖電泳：同1.2.3。

2 結果

2.1 信鴿糞樣中四種常見病原檢測結果

從56份糞便樣品中檢測到40份大腸桿菌陽性率為71.43%(40/56)，見表4、圖1；沙門氏菌檢測為陰性(0/56)，見表4、圖2。檢測的24份cDNA中NDV檢測為陰性，陽性對照成立(1776bp左右的特異性條帶，圖3)；檢測的24份cDNA中AIV-H9檢測為陰性，陽性對照成立(850bp左右的特異性條帶，圖4)。

表4 四種常見病原的檢測結果

圖1 部分大腸桿菌的PCR結果瓊脂凝膠電泳圖

圖2 部分沙門氏菌的PCR結果瓊脂凝膠電泳圖

圖3 部分樣品NDV(NH-S)的PCR結果瓊脂凝膠電泳圖

圖4 部分樣品AIV-H9PCR結果瓊脂凝膠電泳圖

2.2 藥敏試驗檢測結果

隨機取4份大腸桿菌陽性樣品(編號38、42、24、53)，做常用藥物的藥敏試驗。結果表明：4份樣品均對頭孢西丁、頭孢他啶敏感，對諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、環丙沙星、氯霉素、慶大霉素表現為耐藥，對多粘菌素B表現為部分耐藥(見表5)。

表5 4份細菌陽性樣品的藥敏直徑 （mm）

3 討論

（1）鴿新城疫與沙門氏菌的混合感染[3]、鴿NDV與AIV-H9的混合感染[4]、致病性大腸桿菌和沙門氏菌引起鴿腸炎的報道[5]近年來屢次報道。顯然，常見病原的污染以及不合理濫用抗生素，已經成為影響信鴿健康養殖的潛在風險。隨著信鴿飼養業不斷興起，人們對信鴿的健康養殖越來越關注。（2）本研究結果顯示，24份抽檢糞便樣品中NDV與AIV-H9均為陰性，而我們在前期普查中發現該鴿群新城疫抗體均勻度較好(平均6~8log2)，該檢測結果在一定程度上反映出該信鴿場對常見病毒病的防控效果較好。56份糞便樣品未檢出沙門菌，大腸桿菌陽性檢出率為71.43(40/56)，但檢測出來的大腸桿菌是否對信鴿具有致病性仍需要后續實驗加以探究。藥敏試驗顯示為頭孢西丁、頭孢他啶對糞便中細菌敏感，對諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、環丙沙星、氯霉素、慶大霉素表現為耐藥，對多粘菌素B表現為部分耐藥。結果表明，該鴿群細菌耐藥情況嚴重，應采取合理用藥、尋找抗生素的有效替代品等措施來減少耐藥細菌的產生。（3）本研究以該大型信鴿飼養場的新鮮糞便樣品為實驗材料，完成了信鴿四種常見病原的檢測及其耐藥情況測定，該研究對該信鴿群的健康養殖的初步評估及其合理選擇使用抗生素，減少耐藥菌群的出現等方面有一定的指導意義。本批次信鴿糞便樣品中未檢測出NDV、AIV-H9以及沙門氏菌，但更完整全面了解該信鴿群常見病原污染情況，仍需要周期性地采樣檢測病原，并結合血清抗體結果以及臨床癥狀等進一步評估。

[1] 李治, 范俊清等. 信鴿新城疫病毒的分離、鑒定及F基因的進化分析[J]. 中國家禽, 2018, 40(8): 56-59.

[2] 李建國, 覃杰等. 信鴿新城疫的防治[J]. 畜禽業, 2018, 29(8): 138-140.

[3] 楊平, 劉永恒, 張軍等. 一例信鴿新城疫與沙門氏菌混合感染的診斷與治療[J]. 家禽科學, 2015(9): 36-37.

[4] 徐技松, 張軍, 劉永恒. 1例信鴿新城疫的診斷與治療[J]. 養禽與禽病防治, 2016(9): 37-38.

[5] 趙蘭斌. 鴿子的沙門氏菌病的診斷治療[J]. 中國畜牧獸醫文摘, 2018, 34(5) :210-219.

（2018–08–10）

?共同第一作者；

S852.61

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1007-1733(2019)01-0001-03