細胞壁降解酶在植物病原黃單胞菌致病性中的作用研究進展*

郭 威， 高思涵， 孫楚韻， 方 潔， 盧娉婷， 戴瀟雨， 蘇如意

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

0 引 言

黃單胞菌屬(Xanthomonasspp.)細菌是自然界中普遍存在的一類革蘭氏陰性植物病原細菌，其引起的植物病害遍布全世界.據統計，它們可侵染124種單子葉植物和268種雙子葉植物，其中包括重要糧食作物和經濟作物，如水稻、棉花、大豆、柑橘、香蕉、辣椒、甘藍等[1-2].在溫暖潮濕的條件下，黃單胞菌可通過水孔、氣孔或傷口等部位侵入植物的不同器官，引發維管束萎蔫、潰瘍、黑腐、葉枯、葉斑或果斑等多種類型的植物病害，從而導致重大減產和經濟損失[3-4].

黃單胞菌侵染寄主植物過程可分為4個階段：接觸期、侵入期、潛育期和顯癥期[5-6].侵染初期，黃單胞菌附著在寄主植物表面，利用有限的營養生長繁殖[7].當病原菌種群密度達到某一閾值時，通過群體感應(quorum sensing，QS)機制釋放大量的細胞壁降解酶(cell-wall degrading enzymes，CWDEs)，如纖維素酶、蛋白酶、內切-β-甘露聚糖酶、果膠酶、脂肪酶/酯酶、α-淀粉酶、木聚糖酶等，降解植物細胞壁，形成傷口以利于病原菌侵入植物體內[3，6].進入植物體內后，黃單胞菌通過相同的QS機制調控毒性相關基因的表達，以適應寄主體內環境；同時分泌大量的CWDEs，降解植物薄壁細胞/維管束，以利于病原菌獲取大量繁殖所需營養，并定殖到植物體內，最終導致植物病害癥狀的產生[8-9].自20世紀70年代首次報道利用蛋白酶活性評價稻黃單胞菌株毒性指標以來，隨后近半個世紀里，各國植物病理工作者就CWDEs的鑒定，以及CWDEs在黃單胞菌與寄主植物互作中的致病性及誘導抗病性作用等進行了大量研究.筆者將詳細綜述植物病原黃單胞菌中已鑒定的CWDEs的生物學功能，以及CWDEs在寄主植物上的致病性和誘導抗病性作用.

1 植物病原黃單胞菌的Ⅱ型分泌系統

Ⅱ型分泌系統(type Ⅱ secretion system，T2SS)在植物及動物致病細菌中普遍存在，并被廣泛研究[10].病原菌Ⅱ型分泌蛋白(type Ⅱ secretion effectors，T2SEs)分泌至胞外需要2個步驟，首先通過Sec途徑(sec-dependent pathway)或雙精氨酸轉運途徑(twin-arginine translocation pathway，Tat)轉運穿過細胞質內膜，釋放到外周胞質間隙[11]；然后，再借助T2SS將外泌蛋白從外周胞質間隙跨越外膜轉運至細胞表面或外部環境[11-12].通過T2SS，植物病原黃單胞菌將大量CWDEs、毒素等擴散至胞外，破壞或消解寄主植物抗侵染機械屏障，幫助病原菌適應并定殖到植物細胞內，從而引起組織壞死和病害[3-4].

植物病原黃單胞菌擁有2套T2SS，由11個xps基因編碼的Xps系統和由12個xcs基因編碼的Xcs系統組成[13].在辣椒斑點病菌(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria，Xcv)中，Xps系統突變后，菌株的CWDEs活性幾乎全部減弱，但并不完全喪失；Xcs系統突變后，菌株的CWDEs活性及致病力并無影響，但xcs基因可以互補Xps系統中對應同源基因的表型[14].這表明，Xps系統可能是黃單胞菌主要的T2SS；Xps與Xcs兩系統間具有一定的功能冗余或疊加.XpsD是T2SS外膜上的重要組分，起著分子伴侶作用，野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)的CWDEs需與其互作方可分泌至胞外[10].XcsD是否也具有分子伴侶的功能，與CWDEs互作以促進其外泌，目前尚不明確.

2 細胞壁降解酶在植物病原黃單胞菌致病性中的作用

由T2SS分泌的CWDEs在植物病原黃單胞菌致病進程中起著重要作用，它能瓦解由植物細胞壁構筑的防御病原菌入侵的第一道機械屏障；同時能提供病原菌迅速繁殖所需養分，從而促進病害癥狀的發展[3,6],甚至有些CWDEs自身就是致病因子[12,15-16].一種植物病原黃單胞菌能分泌多種CWDEs，具有多樣性.不同植物病原黃單胞菌所分泌的CWDEs也因菌株而異，具有特異性.在植物病原黃單胞菌致病進程中，不同CWDEs需相互協作，具有協同性[17].

2.1 纖維素酶

纖維素酶是植物病原黃單胞菌分泌的,最重要的一類CWDEs，在破壞植物細胞促進病原菌完成寄生性與致病性等方面起著重要作用.然而，目前有關植物病原黃單胞菌纖維素酶的研究，僅局限于少數幾個菌株.2001年，Schr?ter等[18]從XccNRLLB-1459菌株中鑒定出2個胞外纖維素酶基因engXCA(同源于KACC10331XOO4019)與engXCB(Xoo無同源基因)，engXCB基因對菌株的胞外纖維素酶活性貢獻率僅8%，而engXCA/engXCB基因雙突變后，病原菌的胞外纖維素酶活性相對于野生型減弱5倍.2007年，Hu等[19]利用大腸桿菌(BL21/DE3)系統異位表達白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)PXO99A菌株的纖維素酶基因eglXoB(同源于KACC10331XOO0282)，在BL21/DE3菌株胞內能檢測到明顯的纖維素酶活性，eglXoB基因突變后致使病原菌毒性相對于野生型減弱約87%.2007年，Jha等[20]從XooBXO43菌株中鑒定出2個胞外纖維素酶：ClsA(同源于KACC10331 XOO4019)與CbsA(同源于KACC10331 XOO4035)，clsA或cbsA基因單突變后，其菌株的胞外纖維素酶活性相對于野生型顯著減弱，并且顯著削弱病原菌的毒性與生長能力.此外，2016年，Xia等[12]利用大腸桿菌(BL21/DE3)系統異位表達柑橘潰瘍病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)的9個纖維素酶候選基因，從中鑒定出2個具有強烈纖維素酶活性的基因bglC3(同源于KACC10331XOO0283)與engXCA(同源于KACC10331XOO4019)；但是僅BglC3具有胞外纖維素酶活性，而EngXCA雖具有纖維素酶活性卻不能泌出胞外.由此可知，胞外纖維素酶在不同植物病原黃單胞菌菌株中存在差異.此外有研究表明，大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodispv.glycines，Xag)也具有顯著的胞外纖維素酶活性[21]，然而其胞外纖維素酶的編碼基因、數量、致病性及其他生物學特性如何，尚不清楚.

2.2 蛋白酶

自1975年日本學者首次用胞外蛋白酶活性來評判稻黃單胞菌菌株毒性變異以來，胞外蛋白酶活性一直是水稻條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)菌株毒性評價的重要指標[22-23].植物病原黃單胞菌大部分菌株均具有胞外蛋白酶活性，然而有關蛋白酶的研究卻少有報道.在Xcc8004菌株中，全基因組注釋含有6個胞外蛋白酶基因，而PrtA(同源于Xac306 XAC0928)是其主要的胞外蛋白酶，prtA基因突變后，菌株的胞外蛋白酶活性幾乎完全喪失，致病性相對于野生型也顯著減弱[24].2012年，Zou等[16]從XocRS105菌株中鑒定出唯一的胞外蛋白酶EcpA(同源于Xac306 XAC2763)，ecpA突變后，菌株的蛋白酶活性完全喪失，致病性相對于野生型也顯著減弱.然而，稻黃單胞菌另一致病變種XooPXO86，T7174及PXO99A菌株雖擁有同源性完全一致的ecpA基因，PXO86與T7174菌株具有顯著的胞外蛋白酶活性[25]，而PXO99A菌株卻并不具有胞外蛋白酶活性[16,26]，表明EcpA并不是所有Xoo菌株的胞外蛋白酶.2008年，Thowthampitak等[21]曾指出，Xag12-2菌株具有強烈的胞外蛋白酶活性，但未鑒定出具體的胞外蛋白酶基因.本課題組近期研究也發現，Xag另一菌株NEAU001也同樣具有強烈的胞外蛋白酶活性，并從中共篩選出4個胞外蛋白酶，有趣的是，EcpA同源物并不在其中(未發表數據).由此可見，植物病原黃單胞菌的胞外蛋白酶很可能具有多樣性或菌株特異性.

2.3 果膠酶

由帶負電荷的酸性糖苷分子構成的果膠，是植物細胞壁的重要組成部分[27].果膠酶又稱為聚半乳糖醛酸酶，是一種以裂解或消除作用切斷果膠質中的糖苷鍵，并使果膠質裂解成為多聚半乳糖醛酸的復合酶[28].根據對果膠分子作用方式的不同，可將果膠酶分為三大類：解聚酶(催化果膠解聚)、酯酶(催化果膠酯鍵水解)和原果膠酶(催化原果膠解聚)[28].絕大多數的植物病原真菌和細菌均能分泌果膠酶，各種果膠酶分子相互協作，降解寄主植物的果膠聚合物，使細胞壁疏松，以幫助病原菌克服由果膠組成的機械屏障，從而造成寄主植物葉斑病、軟腐病、枯萎病等癥狀[29].

在植物病原黃單胞菌中，有關果膠酶的研究也略有報道.2006年，Kaewnum等[30]從XagKU-P-34017菌株中鑒定出1個果膠裂解酶XagP(同源于KACC10331 XOO0821)，并證實XagP不僅是Xag果膠酶活性所必需的，而且還參與病原菌在非寄主煙草上過敏性反應(hypersensitive response，HR)的誘導.2008年，Wang等[15]從Xcc8004菌株中鑒定出2個果膠酶：PghA(同源于KACC10331 XOO3959)和PghB(同源于KACC10331 XOO2699)，并證實這2種酶是以依賴Xps的方式經由T2SS分泌.此外，pghA與pghB基因受HrpX，HrpG及全局性調控子Clp正調控；兩基因雙突變后，菌株的果膠酶活性降低70%，致病性相對于野生型也顯著減弱.2016年，Tayi等[31]從白葉枯病菌XooBXO43菌株中鑒定出4個果膠酶：1個聚半乳糖醛酸酶PglA(同源于KACC10331 XOO2699)，1個果膠甲基酯酶Pmt(同源于KACC10331 XOO2696)和2個果膠裂解酶Pel(同源于KACC10331 XOO0821)與PelL(同源于KACC10331 XOO2265)，這4個果膠酶編碼基因分別突變后，菌株的果膠酶活性明顯降低，致病性相對于野生型也有所減弱.推斷果膠酶在不同植物病原黃單胞菌中很可能具有高度的同源性，它們除了參與病原菌的果膠酶活性、致病性外，還很可能具有一些其他生物學特性.

2.4 內切-β-甘露聚糖酶

內切-β-甘露聚糖酶不但可以水解半纖維素多糖，如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖等的β-1,4-甘露糖骨架，而且還能通過松弛細胞壁來調控細胞伸長[32].內切-β-甘露聚糖酶普遍存在于動物、植物及微生物中，在植物病原黃單胞菌中更是尤為廣泛.然而，相對于纖維素酶、蛋白酶及果膠酶等，有關內切-β-甘露聚糖酶的研究報道卻相對較少.2003年，Dow等[33]從Xcc8004菌株中鑒定出1個內切-β-甘露聚糖酶ManA(同源于Xcv85-10 XCV1826)，研究發現，manA基因及其編碼產物酶活性受DSF/rpf(diffusible signal factor，DSF/regulation of pathogenicity factors，rpf)系統正調控；manA基因突變后，菌株的內切-β-甘露聚糖酶活性完全喪失，并且病原菌的毒性及生長能力相對于野生型顯著減弱；此外，還發現ManA能促使病原菌菌體由聚集態向游離態轉化，是驅散生物膜形成的分散酶.2010年，Hsiao等[34]再次證實，ManA是XccXc17菌株中唯一的內切-β-甘露聚糖酶，manA基因突變后，菌株的甘露聚糖酶活性完全喪失；此外，還證實manA受刺槐豆膠(locust bean gum，LBG)誘導表達、并受RpfF及Clp正調控.2008年，Thowthampitak等[21]曾指出，Xag12-2菌株具有強烈的胞外內切-β-甘露聚糖酶活性，但并未鑒定出具體的甘露聚糖酶編碼基因.推測ManA很可能是Xcc中唯一的內切-β-甘露聚糖酶，那么ManA是否也是其他植物病原黃單胞菌中主要或唯一的內切-β-甘露聚糖酶，是否對病原菌的致病性具有重要貢獻，有待于進一步驗證.

除了上述提到的CWDEs外，植物病原黃單胞菌還能分泌出脂肪酶/酯酶、α-淀粉酶、木聚糖酶等.但是，不同植物病原黃單胞菌分泌CWDEs的酶活性及種類因菌株而異，或者說具有菌株特異性，例如：Xcc菌株不能分泌木聚糖酶，部分Xoo菌株不能分泌蛋白酶，而Xoc與Xag菌株分泌的果膠酶量/活性極少.在黃單胞菌與寄主植物互作過程中，各種CWDEs相互協作，破壞植物細胞壁以促進病原菌在寄主植物上寄生與致病.與此同時，部分CWDEs本身就是黃單胞菌的毒性因子，在病原菌致病過程中起著重要作用.

3 植物病原黃單胞菌Ⅱ、Ⅲ型分泌系統相

互協作調控病原菌在寄主上的毒性由hrp-hrc-hpa基因簇編碼的Ⅲ型分泌系統(type Ⅲ secretion system，T3SS)是植物病原黃單胞菌中高度保守的、最重要的致病系統[35-36].通過T3SS，黃單胞菌將大量Ⅲ型效應蛋白(type Ⅲ secretion effectors，T3SEs)注入寄主細胞，抑制寄主先天免疫反應，從而促進病原菌在寄主植物上的寄生性與致病性[37-38].

由植物病原黃單胞菌T2SS分泌的CWDEs具有雙重功能，一方面能降解植物細胞壁，引起或促進植物病害；另一方面能誘導植物防衛反應，如細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)、胼胝質沉積(callose deposition)等.2007年，Jha等[20]研究發現，體外表達純化的XooBXO43菌株的纖維素酶(CbsA和ClsA)與脂肪酶/酯酶(LipA)均能誘導細胞壁相關的基礎免疫，如PCD、胼胝質沉積等.2012年，Zou等[16]也發現，體外表達純化的Xoc胞外蛋白酶EcpA也能誘導類似的植物防衛反應.2013年，Sinha等[38]采用農桿菌系統瞬時表達XooBXO43菌株的T3SEs方式，從15個候選T3SEs中篩選出4個能抑制LipA誘導的細胞壁相關基礎免疫的效應蛋白，如XopN，XopQ，XopX和XopZ.2016年，Tayi等[39]首次報道，XooBXO43菌株的纖維素酶(CbsA和ClsA)和木聚糖酶(Xyn)在病原菌侵染過程中均能誘導細胞壁相關的基礎免疫，而脂肪酶/酯酶(LipA)和果膠酶(PglA)在病原菌侵染過程中并不能誘導這種基礎免疫.上文所引用的3位作者Jha，Sinha與Tayi均來自于印度學者Ramesh的課題組，該研究小組在植物病原黃單胞菌CWDEs誘導植物先天免疫反應領域作出了重要貢獻.比較Jha與Tayi的論文可推測，在體外條件下植物病原黃單胞菌CWDEs均能誘導植物細胞壁相關的基礎免疫，而在體內條件下CWDEs是否能誘導這種基礎免疫很可能取決于自身分泌活性或量的大小.Ramesh研究組[39]指出，黃單胞菌CWDEs誘導的細胞壁相關的這種基礎免疫，是源于CWDEs破壞寄主植物細胞壁而釋放的損害相關分子(damage-associated molecular patterns，DAMPs)誘導植物產生的免疫反應.然而，目前為止，關于DAMPs的真實身份還一無所知.此外，關于能抑制CWDEs誘導先天免疫反應的T3SEs也知之甚少.

4 總結與展望

過去近半個世紀的研究工作充分證明，植物病原黃單胞菌CWDEs至少具有以下特點：1)具有多樣性，一種植物病原黃單胞菌能分泌多種CWDEs；2)具有特異性，不同植物病原黃單胞菌所分泌的CWDEs因菌株而異；3)具有協同性，在植物病原黃單胞菌致病進程中，不同CWDEs需相互協作；4)具有雙重功能，一方面能降解植物細胞壁，促進或引起植物病害；另一方面能誘導植物防衛反應，如PCD、胼胝質沉積等.然而這些研究工作主要集中在維管束病原菌Xcc與Xoo上，在其他植物病原黃單胞菌(如薄壁細胞病原菌Xag)上還鮮有報道.此外，在黃單胞菌CWDEs與寄主植物互作機制等方面，還有許多科學問題需要回答.因而，未來研究工作應包括以下方面：1)鑒定其他植物病原黃單胞菌的CWDEs，并揭示不同菌株CWDEs的差異性與多樣性；2)全基因組內挖掘CWDEs誘導致使寄主植物顯著變化的基因，特別是病程相關基因(pathogenesis-related genes)等；3)探究不同類CWDEs在誘導寄主植物先天免疫反應上，是否具有功能疊加或冗余，抑或具有協同作用；4)鑒定由CWDEs破壞寄主植物細胞壁而釋放的DAMPs；5)篩選抑制CWDEs所誘導先天免疫反應的T3SEs，并揭示其抑制先天免疫反應的方式；6)探究參與CWDEs誘導先天免疫反應的受體、信號元件及轉錄因子等.在這些領域開展廣泛的研究，無疑將促進對黃單胞菌與寄主植物互作機理更深入的理解，為植物細菌病害的生物防治策略開拓新的途徑.