響應曲面法優化超聲波輔助提取艾葉中總黃酮的工藝研究

蔡 敏

(廣西現代職業技術學院資源工程系，廣西 河池 547000)

引 言

艾葉(folium artemisiae argyi )，別名大艾葉、杜艾葉、蔞蒿，為菊科植物艾的葉[1]，是一種分布廣泛的多年生草本植物。現代藥理實驗表明黃酮類物質不但具有降血壓、降血脂、緩解心血管疾病、抗菌消炎等作用，還具有抗氧化、抗衰老、增強機體免疫力等生理活性作用[2]，被廣泛地應用于醫藥、食品等領域。

目前已有不少學者對植物中黃酮類化合物的提取方法作了研究，黃酮類化合物的提取方法有微波提取法[3]、溶劑提取法[4]、酶解法[5-6]、超聲波提取法[7]等。與其他方法相比，超聲波提取黃酮類物質，是目前比較新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮艾葉，采于廣西河池市；蘆丁對照品，成都曼思特生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 實驗設備

KQ2200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SD101-2電熱鼓風干燥箱，南通金石實驗儀器有限公司；RE52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，常州市衡正電子儀器有限公司； SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；UV-1800-PC-DS2分光光度計，上海美譜儀器有限公司；高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 艾葉總黃酮超聲提取方法

準確稱取2.000 g用高速萬能粉碎機粉碎后的艾葉干粉，按一定液固比加入一定體積分數的乙醇水溶液，浸泡24 h；在超聲波清洗器中超聲提取一定時間，抽濾，將提取液用旋轉蒸發儀減壓濃縮，除去溶劑。

1.4 紫外分光光度法測定總黃酮含量

1.4.1 蘆丁標準溶液的配置

準確稱取蘆丁對照品20 mg，置于50 mL燒杯中，用60%乙醇水溶液(體積分數，下同)溶解，并轉入100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.2 mg·mL-1的標準溶液。

1.4.2 蘆丁回歸方程的建立

參照文獻[8]，采用NaNO2-Al(NO3)NaOH顯色體系進行顯色，以試劑空白作參比，在波長510 nm處測定吸光度值，以質量濃度C(mg·mL-1)為縱坐標， 吸光度A為橫坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法進行線性回歸，得蘆丁溶液質量濃度C(mg·mL-1)和A關系曲線的回歸方程為：C=0.090 9A-0.000 145，R2=0.999 8。

1.4.3 總黃酮含量的測定

將1.3中的濃縮液轉移到100 mL的容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度。精密量取1.0 mL艾葉黃酮提取液，采用NaNO2-Al(NO3)NaOH顯色體系進行顯色分析[8]，以空白試劑為參比溶液測定其在測定波長510 nm處的吸光度值，根據標準曲線線性回歸方程式計算出提取液中的黃酮濃度，再換算成處理后的艾葉中總黃酮含量。

1.5 單因素實驗

稱取2.000 g艾葉，固定乙醇體積分數、超聲波提取時間、液固比、提取溫度其中的一個因素，考察其他因素對艾葉中總黃酮提取率的影響。

1.6 Box-Behnken實驗

在單因素實驗結果的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合設計原理設計自變量，以艾葉總黃酮提取率為響應值，通過響應曲面分析進行超聲波輔助提取艾葉中總黃酮條件的優化。

1.7 驗證實驗

利用響應面軟件分析進行實驗，分別測定總黃酮含量，將實驗結果與實驗方案相比較，得到黃酮實際平均含量。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對艾葉總黃酮提取率的影響

稱取2.000 g艾葉樣品，按20∶1(mL∶g)的液固比分別加入不同體積分數的乙醇溶液，浸泡24 h；在超聲波清洗器中于40 ℃超聲提取60 min，不同體積分數乙醇對艾葉總黃酮提取率的影響結果見表1。

表1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

由表1可以看出，艾葉總黃酮的含量開始隨乙醇濃度的增大而增加，當乙醇體積分數達到60%時，總黃酮提取率達到最大，再增加乙醇體積分數，艾葉中非極性物質溶解度增大，總黃酮提取率下降，故選用乙醇體積分數為60%。

2.1.2 提取時間對艾葉總黃酮提取率的影響

稱取2.000 g艾葉樣品，按20∶1(mL∶g)的液固比加入60%乙醇溶液，浸泡24 h；在超聲波清洗器中于40 ℃提取不同時間， 提取時間對艾葉總黃酮提取率的影響結果見表2。

表2 提取時間對總黃酮提取率的影響

由表2可以看出，總黃酮含量隨著超聲波作用時間的延長增加。當提取時間達到60 min后，總黃酮提取率增加緩慢，故選用提取時間60 min～70 min。

2.1.3 液固比對艾葉總黃酮提取率的影響

稱取2.000 g艾葉樣品，分別按不同液固比(mL/g)加入60%乙醇溶液，浸泡24 h；在超聲波清洗器中于40 ℃提取60 min，不同液固比對艾葉總黃酮提取率的影響結果見表3。

表3 液固比對總黃酮提取率的影響

由表3可以看出，料液比達到20∶1時，總黃酮的提取率較高，再增加溶劑量，提取率增加不大，故選取液固比為20∶1～25∶1。

2.1.4 提取溫度對艾葉總黃酮提取率的影響

稱取2.000 g艾葉樣品，按20∶1(mL：g)的液固比加入60%乙醇溶液，浸泡24 h；在超聲波清洗器中不同溫度下提取60 min，不同提取溫度對艾葉總黃酮提取率的影響結果見表4。

表4 提取溫度對總黃酮提取率的影響

由表4可以看出，提取溫度在40 ℃～50 ℃總黃酮提取率較高。

2.2 提取工藝的響應面法優化

2.2.1 響應面實驗設計及結果

綜合單因素實驗結果，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，選取乙醇體積分數、提取時間、液固比、提取溫度對艾葉總黃酮的提取率影響顯著的4個因素，在單因素的基礎上，采用4因素3水平的的響應面分析法進行實驗設計，設計表及結果見第9頁表5。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗

利用Design expert V8.0.6統計軟件通過逐步回歸對表5實驗數據進行回歸擬合，得到得率對以上3個因素的二次多項回歸模型為：

提取率=9.13+0.20A-0.23B-0.067C-0.042D+0.22AB-0.25AC-0.27AD-0.50BC-0.19BD-0.46CD-1.07A2-0.63B2-1.22C2-1.01D2

對該模型進行方差及顯著性分析，得出回歸模型系數顯著性結果，見第9頁表6。

由方差分析表(表6)可見，模型具有顯著性，該模型的R2=0.9687，說明與實際實驗擬合較好，因此可用該模型對艾葉中總黃酮工藝結果進行分析和預測。

表5 響應面實驗設計及結果

表6 響應面二次回歸方程方差分析

2.2.3 響應曲面分析

根據回歸方程，作響應曲面圖，見圖1～圖2及第10頁圖3～圖4。等高線形狀表示兩因素交互關系強弱，如為橢圓形，說明兩因素交互影響極顯著。比較4組圖并結合表6可知，乙醇體積分數(A)、提取時間(B)達到了極顯著水平(P<0.01)，二次項中所有因素都是極顯著的，在交互項中，乙醇體積分數(A)與提取時間(B)、提取時間(B)與提取溫度(D)沒有顯著性(P>0.05)，提取時間(B)與液固比(C)、液固比(C)與提取溫度(D)對提取率(Y)均有極顯著性影響(P<0.01)，乙醇體積分數(A)與液固比(C)、乙醇體積分數(A)與提取溫度(D)對提取率(Y)有顯著影響(P<0.05)。

圖1 乙醇體積分數(A)與液固比(C)對艾葉總黃酮提取率影響的響應圖和等高線

圖2 乙醇體積分數(A)與提取溫度(D)對艾葉總黃酮提取率影響的響應圖和等高線

圖3 提取時間(B)與液固比(C)對艾葉總黃酮提取率影響的響應圖和等高線

圖4 液固比(C)與提取溫度(D)對艾葉總黃酮提取率影響的響應圖和等高線

2.3 驗證實驗

為檢驗響應曲面法所得結果的可行性，采用優化后的提取條件對艾葉總黃酮進行提取，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝參數修正為乙醇體積分數60%，提取時間60 min，液固比為20∶1，提取溫度為40 ℃，經過3次平行實驗，總黃酮的提取率分別為9.18%，9.12%，9.15%。

3 結論

利用軟件Design-Expert8.0.6，通過響應曲面分析，得到了各因素的最佳范圍：乙醇體積分數為60%，提取時間為60 min，液固比為20∶1，提取溫度為40 ℃。驗證實驗結果表明，超聲波法提取艾葉中總黃酮的提取率為9.15%。實驗為艾葉中提取總黃酮的工業化生產提供了一定的理論基礎，為開發利用廣西豐富的中藥材資源起到積極的促進作用。