利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立斑馬魚sonic hedgehog基因敲除模型及視網膜發(fā)育表型的初步鑒定

張昕，姜悅，張青宇，郭錫熔，池霞，童梅玲

(南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院/南京市婦幼保健院 兒童保健科，江蘇 南京 210004)

sonic hedgehog(shh)是一類分泌性蛋白，其介導的shh信號通路與視網膜發(fā)育密切相關[1]，它能影響視網膜祖細胞的分化，決定感光細胞的發(fā)育以及視網膜的分層結構等。然而，目前有關shh及其介導的信號通路調控視網膜發(fā)育機制的報道仍較少。

本研究采用CRISPR/Cas9對斑馬魚的shh基因進行編輯[2- 3]，通過鑒定及篩選，初步建立shh基因敲除斑馬魚模型，并比較shh基因突變斑馬魚與野生型斑馬魚形態(tài)及相關眼發(fā)育的不同，研究shh基因對斑馬魚生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚飼養(yǎng)

實驗動物為德國Tubingen品系，購于南京大學模式動物中心。喂養(yǎng)及產卵方法按照zebrafish Book常規(guī)進行，照明14 h、黑暗10 h交替，飼養(yǎng)在循環(huán)水中，水溫保持在(26±2)℃。每天投喂3次豐年蝦片。動物實驗所有操作均得到南京醫(yī)科大學實驗動物管理與使用委員會批準。

1.2 sgRNA的制備及斑馬魚受精卵顯微注射

分析得到斑馬魚shha蛋白質的保守結構功能域，將待敲除目標序列設計在編碼114aa之后的基因組序列上。設計引物gRNA- 1和gRNA- 2。將sgRNA1、sgRNA2和Cas9 mRNA以一定量混合后，顯微注入斑馬魚受精卵，待胚胎發(fā)育至受精后7 h(hours post- fertilization, hpf)時，隨機取5枚胚胎進行鑒定，確定sgRNA的活性。

1.3 斑馬魚模型的構建和篩選

將得到的shha基因敲除的F0代斑馬魚，剪取尾鰭提取DNA，PCR擴增驗證測序，鑒定出F0代突變基因型。獲得F1，通過剪取尾鰭進行基因型鑒定。再以引物對shha F和shha R進行PCR擴增，并用shha F- 2(TAGAAACGTTAAACAACGGC)進行測序，通過閱讀測序的色譜圖，確定F1是否為攜帶shha等位基因突變的突變體。將shha突變體F1(♂)和野生型斑馬魚(♀)進行交配，收集胚胎(F2)，飼養(yǎng)至2個月齡，對F2代進行基因型鑒定。

1.4 斑馬魚形態(tài)學觀察及HE染色

收集受精后4 d(days post- fertilization, dpf)斑馬魚幼魚各6條，置于4%多聚甲醛中，進行石蠟包埋切片，用二甲苯進行脫蠟，無水乙醇進行水化，行HE染色，在倒置顯微鏡下觀察野生型及突變體斑馬魚胚胎的發(fā)育變化，并采用捷達病理圖像分析系統(tǒng)軟件進行拍照。

2 結 果

2.1 sgRNA識別點及鑒定

根據(jù)蛋白質保守功能結構域，將待敲除的目標序列(sgRNA識別序列)設計在編碼114aa之后(HH- signal)的基因組序列上，設計序列為shha F(AATTTGGGAATTGTTTGGAGA)、shha R (GAGAGGGAGTGTGAAGCATTG)、shha- sgRNA1(GAAGAATCACTCCACTACGA【GGG】)、shha- sgRNA2(GACACTGTCTCGCCTAGCTG【TGG】)。結果表明至少sgRNA2具有活性，且活性大于7.1%。

2.2 F0代基因突變斑馬魚檢測及F1代建立

結果表明，F(xiàn)0代shha基因敲除的初建者,基因組中突變基因型比例>5%，對109尾F1魚進行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)有8尾攜帶突變的等位基因，其中7尾發(fā)生移碼突變，根據(jù)基因分析結果，最終確定4號突變體為后續(xù)研究對象，如圖1所示。

2.3 斑馬魚shha基因敲除雜交突變體體系的建立

根據(jù)突變體類型，分別設計鑒定野生型和突變體的引物，并對其進行驗證，結果顯示：引物shha- 4bp wt F2(GGACACTGTCTCGCCTAGCT)/shha R(GAGAGGGAGTGTGAAGCATTG)和shha- 4bp mut F1(GGACACTGTCTCGCCTGT)/shha R(GAGAGGGAGTGTGAAGCATTG)可以用于shha突變體的鑒定。F2代斑馬魚17尾中有10尾shha雜合突變。以2號和3號斑馬魚基因組為模板進行PCR擴增，并以F- shha- 3進行Sanger測序，對上述PCR結果進行驗證。測序結果表明，建立的PCR法進行基因型鑒定是有效的，見圖2A～B。

A～E方框處為sgRNA，除外B，部分序列已發(fā)生indel突變

圖1F1代斑馬魚基因型鑒定

A.19尾斑馬魚擴增電泳圖；B.測序驗證結果圖

圖2F2代突變體引物設計驗證

利用已建立的PCR法對116條F2代斑馬魚進行鑒定，發(fā)現(xiàn)共有shha雜合突變后代41尾；進一步PCR驗證及測序，結果表明41尾斑馬魚尾攜帶shha移碼突變的雜合突變體，見圖3。

2.4 Shha+/-突變斑馬魚形態(tài)變化及HE染色

與野生型斑馬魚相比，shha+/-突變體胚胎及幼魚多個系統(tǒng)的發(fā)育受到明顯影響，出現(xiàn)魚卵發(fā)育停滯、脊柱彎曲、心包水腫、眼球發(fā)育較小等異常。受精后96 h，HE染色可見：與同齡野生型斑馬魚相比，突變體視網膜細胞分層排列，但感光細胞及視神經細胞發(fā)育較差，細胞排列不規(guī)則，細胞數(shù)減少，細胞核增大，見圖4。

3 討 論

眼睛是大腦的延伸，是重要的感覺器官。胚胎發(fā)育期間，表面外胚層形成晶狀體和角膜，與前神經板形成視網膜上皮層的虹膜和睫狀體[4]。如果在這一時期出現(xiàn)發(fā)育干擾，就會出現(xiàn)各種眼病，如先天性白內障、青光眼和視網膜病，這些疾病發(fā)生均與視網膜感光細胞及神經節(jié)細胞受損相關。還有學者證實，實驗性剝奪性近視是由于視網膜感光細胞形態(tài)學的改變所致。目前國內越來越多的兒童出現(xiàn)視力障礙[5]，進一步對其機制進行研究很有必要。

A.87尾斑馬魚擴增電泳圖;B.shha雜合突變后代41尾;C、D.41尾突變體測序鑒定圖

圖3F2代斑馬魚突變體鑒定

A.對照組；B.突變體

圖4視網膜發(fā)育初步表型鑒定

斑馬魚作為一類具有高度視覺的物種，其通體透明，眼球占頭部體積較大，視網膜與人類具有相似的生理學和形態(tài)學特點，使它成為研究眼球發(fā)育和功能基因控制的理想模型[6- 7]。斑馬魚的視網膜發(fā)育與其他脊椎動物一樣，遵循兩個原則：從中間到周邊，從內到外。多能神經前體細胞在受精后27～28 hpf首先分化成視網膜神經節(jié)細胞(RGC)，隨后依次分化形成內叢狀層、無軸突細胞層、外叢狀層，于43 hpf出現(xiàn)感光細胞層，96 hpf時幼魚孵化完全，其視網膜功能逐步成熟[8- 10]。因此，采用斑馬魚為模式動物可以更好地動態(tài)觀察視網膜的發(fā)育。

脊椎動物的視網膜發(fā)育受許多因素調控，其中shh及其介導的信號通路與視網膜發(fā)育密切相關。細胞分泌shh蛋白后，由靶細胞膜上的patch和smo兩種受體接收信號，再通過激活下游Gli分子發(fā)揮作用[11]。研究表明：shh參與視網膜神經節(jié)細胞及感光細胞的發(fā)育過程[12- 13]；用shh氨基酸片段處理可使體外培養(yǎng)的小鼠視網膜感光細胞比例升高[14]；抗shh抗體會影響雞胚視網膜色素上皮細胞的生成[15]。由此可見，shh及其介導的信號通路在視網膜發(fā)育中承擔著重要角色。

研究表明，在Cas9顯微注射的斑馬魚受精卵中，平均約50%能夠發(fā)育成為穩(wěn)定的突變品系并向下傳遞[16]。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，以斑馬魚作為模式動物，在shh第2個外顯子上設計sgRNA靶點，引導Cas9 mRNA進行特異性剪切，建立shh移碼突變斑馬魚敲除模型。對F2代斑馬魚進行鑒定時發(fā)現(xiàn)，其純合子、雜合子、野生型比例不符合孟德爾定律，推測shh純合子可能致死，具體機制仍需進一步研究。本研究結果發(fā)現(xiàn)，shha+/-突變體胚胎及幼魚出現(xiàn)魚卵發(fā)育停滯、脊柱彎曲、心包水腫、眼球發(fā)育較小等多種異常，推測shh在各個系統(tǒng)發(fā)育中均起到重要作用。96 hpf時，利用HE染色發(fā)現(xiàn)，shh+/- 斑馬魚視網膜分層排列，但感光細胞及神經節(jié)細胞發(fā)育差，細胞排列紊亂，細胞數(shù)減少，胞核變大，據(jù)此可以推斷，shh可能通過影響視網膜感光細胞及神經節(jié)細胞的發(fā)育來參與相關眼病的發(fā)生。

在視網膜發(fā)育過程中，shh的作用不可或缺，但目前其具體的調控過程及敲除后造成的視網膜損傷機制仍不清楚，需要進一步探索。本次研究建立了shh突變斑馬魚模型，為后續(xù)研究提供良好的動物模型，為下一步研究致病機制及相關信號通路打下基礎。