同位素稀釋技術結合超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜快速精準測定飼料及原料中16種霉菌毒素

符金華， 楊琳芬， 董澤民*， 徐國茂， 姜文娟 ， 邢 磊，黃艷清， 李瑾瑾， 周仁丹， 葉 金， 吳 宇， 廖 豐

（1.江西省獸藥飼料監察所，江西南昌 330096；2.南昌大學分析測試中心，江西南昌 330047；3.國家糧食局科學研究院，北京西城 100037；4.雙胞胎（集團）股份有限公司，江西南昌 330096）

霉菌毒素是真菌在適宜環境條件下產生的次級代謝產物，其對人和畜禽具有致癌、致畸、致突變作用（朱聰英等，2010）。飼料及其原料特別易于被霉菌毒素污染（Binder等，2007），從而降低飼料的口感與質量，給畜牧業發展和畜產品安全造成極大的危害。其中，對人和畜禽毒性較大毒害的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮等數十種（Marin 等，2013；鄭翠梅等，2012）。因此，飼料及原料中各種毒素的限量和檢測要求日趨嚴格。

目前，霉菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC） 、熒光/酶聯免疫法（ELISA） 、高效液相色譜法（HPLC）及氣相色譜串聯質譜（GC-MS）等（朱 聰英等 ，2010；Cavaliere 等，2007；Chiar 等 ，2007）。雖然在一定程度上能夠滿足目前部分毒素的檢測，但也存在諸多問題。如TLC法的穩定性和重復性差，易受外界環境的干擾；ELISA法通常作為篩選方法，不能準確定量，且易出現假陽性；HPLC法容易受到基質干擾，檢測通量不夠，且部分毒素的檢測限達不到限量標準要求；GC-MS法的操作步驟繁瑣，衍生化的效率低等。另外，實際的飼料樣品中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素同時污染 （Monbaliu等，2009），而這些方法檢測的毒素種類比較單一。

因此，開發出飼料及原料中多種霉菌毒素一步檢測方法具有十分重要的現實意義。超高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）是一種集高效分離和多組分同時定性、定量于一體的檢測技術，具有較強抗基體干擾能力、高通量、高選擇性、高靈敏度等優勢，成為近年來痕量檢測中發展非?？斓男录夹g之一 （Markus等，2012；Johannes等，2012；Mira等，2010；Micheal等，2009）。 但HPLC-MS/MS法均需要專用的前處理設備耗材，提取凈化步驟繁瑣，且霉菌毒素的檢測種類面仍然比較窄 （Shephard 等，2012；趙孔祥等，2011）。 本研究建立了一種飼料及原料中16種霉菌毒素的超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質譜檢測法（Q-trap-UPLC-MS/MS）。樣品經簡單的提取、同位素稀釋后直接檢測，不需要過多功能凈化柱及脫脂等操作，實現了一次前處理和一針進樣，同時精確檢測16種霉菌毒素。該方法具有操作簡單、快速、低成本、定量準確，對批量飼料及原料樣品中霉菌毒素的快速監測意義重大。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑 質譜型號為Sciex4500 Qtrap（美國 Sciex公司）；液相為島津LC-20AD XR（日本Shimadzu公司）；赫西離心機（中國 湖南赫西儀器裝備有限公司）；HY-3多功能振蕩器 （中國江蘇光都機電設備有限公司）：Milli-Q超純水純化系統（美國Millipore公司）；METTLER TOLEDO ME104分析天平（中國 梅特勒-托利多（上海）有限公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；乙酸銨、甲酸、乙酸（HPLC 級，美國 Sigma公司）；0.2 μm PTFE膜針頭過濾器 （PALL公司）；實驗用水為Milli-Q超純水。分別移取一定體積的16種霉菌毒素標準溶液 （濃度為0.01～2.5μg/mL，購自Romer公司）于10mL容量瓶中，水定容，得到16種霉菌毒素混標，于-20℃保存，濃度詳見表1。

表1 真菌毒素混合標準儲備液的濃度及相應的穩定同位素混合溶液

穩定同位素內標混合工作液：分別移取一定體積的14種霉菌毒素穩定同位素單標 （濃度為0.01～2.5μg/mL，購自 Romer公司）于 4mL儲液瓶中，用水稀釋至2mL配制穩定同位素混標，充分混勻后于-20℃避光保存。準確移取適量混合標準中間儲備液，用乙腈-水-乙酸溶液（35：64.5：0.5）逐級稀釋，配制成不同濃度系列的混合標準工作液。向400μL內插管中加入20μL 14種穩定同位素混合工作液，再分別吸取180μL系列標準工作液于內插管中，渦旋混勻后準備上機檢測。1.2 實驗方法 液相色譜條件：Waters公司CORTECSTM UPLC C18柱 （100 mm ×2.1 mm，1.6μm）；柱溫40℃；進樣量2μL；流動相A為甲醇，B為含0.1%（體積分數）的甲酸和1mmol/L乙酸銨的水溶液；流速為0.3mL/min；采用梯度洗脫。

質譜條件：加熱電噴霧離子源溫度為500℃；噴霧電壓為5500 V；離子傳輸管溫度為320℃；gas1和 gas2均為50 psi，氣簾氣為35 psi。EPI掃描速度 10000 Da/s，掃描質量范圍50～1000，分段多反應監測掃描模式，MRM檢測窗口設置為30 s，錐孔電壓50 V；正、負離子采集；監測離子、碰撞池能量等參數見表2。

稱取飼料樣品 （5±0.1）g于50mL離心管中，準確加入 20mL 乙腈/水/乙酸 （V/V/V：70/29/1）提取溶劑，渦旋2min，振蕩30min，以4000 r/min離心10min使固液分離。準確轉移0.5mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL水稀釋，渦旋混勻1 min，然后以12 000 r/min離心10min，取上清液用0.22μm的PTFE濾膜過濾，吸取20μL預先渦旋混勻的穩定同位素混合溶液于400μL內插管中，再加入180μL的樣品濾液，混合后待測。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察 本研究選擇的樣品前處理提取溶劑為乙腈/水/乙酸（V/V/V：70/29/1），提取液經直接提取稀釋，加入同位素內標后，上機檢測。選擇含有0.1%甲酸的1mmol/L NH4Ac的水相作為弱洗脫流動相，甲醇為強洗脫流動相，且采用梯度洗脫程序。質譜采用正、負離子模式下獲得［M+H］+、［M+NH4］+吸收峰，采用分段多反應監測模式（MRM）掃描模式，離子源溫度為500℃，駐留時間為100ms，得到精確保留時間和選擇離子精確質量數、信號采集的特征離子對及質譜條件見表2。

表2 16種真菌毒素的精確保留時間、質量數及質譜條件

按照上述優化的條件，得到了16種毒素的高質量離子信號、低干擾離子信號及理想的總離子色譜峰（圖 1）。

圖1 16種真菌毒素標準混合溶液的總離子流色譜圖

2.2 方法學考察

2.2.1 基質效應 常見5大類配合飼料和4種原料的基質效應見圖2所示。以目標物在空白基質液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來評估基質效應，當結果接近100%時，表明無明顯的基質效應，而高于100%說明有基質增強效應，低于100%則說明有基質抑制效應。在5類配合飼料和4種原料基質中，16種霉菌毒素的基質效應較為相似。FB1、FB2、OTA和T2四種毒素呈現基質增強效 應 ，DON、DON-3G、3-AcDON、15-AcDON、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、NIV 及 ZEN 等 10 種 毒素呈現基質抑制效應，HT-2和ST毒素的基質效應較弱。在5類配合飼料和4種原料中，各霉菌毒素的基質效應分別為60.3%～122.3%和54.0%～124.3%，說明存在一定的基質增強或抑制效應。

圖2 16種霉菌毒素在5種配合飼料及4種原料中的基質效應（n=3）

然而，基質匹配標準曲線是一種常見的減少基質效應的方法，但由于霉菌毒素污染的普遍性，空白基質不易獲得，特別是完全匹配的基質更難獲得，而代表性基質的普適性面臨挑戰，具有較大的不確定性，導致基質匹配定量在標準化檢測中的應用受到局限。因此，為了更好消除基質效應的影響，本實驗采用穩定同位素稀釋法進行定量，以確保結果的準確可靠。

2.2.2 線性范圍、檢出限及定量下限 由表3可知，在各自的線性范圍內，16種霉菌毒素線性關系良好，相關系數（R2）均＞0.998。對混合標準溶液進行逐級稀釋，以3倍信噪比（S/N）計算檢出限（LOD），10倍信噪比計算定量下限（LOQ）。 16種霉菌毒素的LOQ均低于我國和歐盟規定的飼料及原料中的限量值，說明本方法可以滿足日常檢測的需要。

表3 16種霉菌毒素的線性范圍、檢出限及定量下限

2.2.3 準確度與精密度 取16種霉菌毒素含量較低（低于方法檢出限）的5類常見的配合飼料和4種常見的飼料原料樣品。分別添加高、中、低3個濃度水平的混合標準溶液，每個加標水平進行6次重復實驗，添加濃度、回收率及相對標準偏差（RSD）見表4和表5。其中，16種霉菌毒素在5種常見配合飼料中的回收率絕大數為70.2%～129.5%，只有極個別毒素的回收率為66.9%～69.9%。如犢牛飼料中AFG1、DON、DON-3G毒素的回收率偏低，FB1、FB2毒素的回收率偏高；但FB1、FB2毒素在魚、鴨飼料中的回收率偏低，這可能與這些飼料中含有菜籽粕、DDGS等原料有關，且與基質效應的結果保持一致。同時，16種霉菌毒素回收率的RSD值均在0.1%～14.5%。

16種霉菌毒素在豆粕、玉米、菜籽粕和魚粉4種常見的飼料原料中的回收率絕大部分為80.2% ～116.1%，只有FB1、FB2毒素在豆粕中的回收率為66.4%～70.9%，稍微偏低，這可能是豆粕中的蛋白質含量較高，對部分毒素具有一定的吸附性而造成。同時，所有16種毒素回收率的RSD值均在0.1%～7.7%，兩大類基質中的回收率和RSD均符合相關法規的檢測要求。

2.2.4 質控樣品的考察 為了進一步驗證本方法的準確性和適用性，使用本方法FAPAS能力測試玉米樣品。結果如表6所示，證書標示的8種真菌毒素的檢測值均在范圍內，且接近標示中值，表明本方法準確可靠。相比于傳統的商品化MycoSpin 400多毒素凈化小柱和普通三重四極桿質譜 （安捷倫6410B）的檢測方法，兩種方法的相對平均偏差均不大于7.1%，結果無顯著性差異。但Qtrap質譜技術結合穩定同位素稀釋方法定量更加簡單，且無需對樣品提取液進行凈化，對多目標物的分析時可有效減少建立儀器方法的難度與時間，便于實驗室快速建立準確可靠的定量方法以開展批量樣品的日常檢測。

2.3 實際樣品檢測 按照上述優化的各項條件，16種霉菌毒素的系列混合標準溶液進行上機分析，以穩定同位素稀釋法進行定量。結果表明，16種毒素標準品能夠有效分離，得到精確保留時間。同時，得到了所有的選擇離子精確質量，質量數與理論計算值非常接近。因此，16種毒素的HPLC/MS/MS方法條件優化完成，可以滿足實際應用于樣品的日常檢測。

采用本研究中建立的方法對某地區的134份豬飼料、禽飼料、牛飼料及各種原料樣品進行檢測。 飼料衛生標準（GB 13078-2001，2001）規定了飼料及原料中最高限量的6種霉菌毒素：AFB1、ZEN和DON超標率分別為4.5%、3.0%、2.2%，T-2、（FB1+FB2）及OTA 超標率均為0.0%。對飼料衛生標準未規定限量值的其他毒素，參考本方法中各毒素的檢出限，16種毒素的檢測數據見表7和表8。結果顯示，其他尚沒有限量值的霉菌毒素均有 不 同 程 度 的 檢 出 ，15-AcDON、AFG1、AFG2、DON-3G、AFB2、HT-2、ST 等毒素的檢出較高，均超過80%。說明了近年來由于氣候的異常，可能導致我國部分地區的飼料及原料中霉菌毒素污染較為普遍。因此，加強日常監測尤為重要，而本方法可適用于大量飼料及原料樣品中多毒素污染的風險預警及快速準確定量篩查。

3 結論

基于Q-trap-UPLC-MS/MS結合穩定同位素稀釋技術，建立了飼料及原料中16種霉菌毒素的快速準確檢測方法。樣品通過簡單的提取、稀釋、離心和過膜等步驟即可上機檢測，無需凈化操作。采用加標回收法和測定基體標準物質驗證了方法的準確度和精密度，方法可適用于國內外的飼料及原料中霉菌毒素的限量檢測要求。本方法前處理快速，有效避免了基質效應的干擾及檢測結果準確，可滿足日常批量飼料及原料樣品中霉菌毒素快速定性和精確定量分析的要求。

表4 常見5種飼料中16種霉菌毒素的回收率與相對標準偏差（n=6）

表5 常見4種飼料原料中16種真菌毒素的回收率與相對標準偏差（n=6）

表6 FAPAS能力測試樣品的檢測結果

表7 134份飼料及原料樣品中16種霉菌毒素的檢測結果

表8 10份飼料樣品中霉菌毒素的含量

注：“N/F”：未檢出或低于方法檢出限。

化合物 樣品49 樣品52 15-ACDON N/F 1320.57 3-ACDON N/F 4878.66 AFB167.36 102.4樣品58 623.2 83.2 56.24樣品88 N/F N/F 332樣品97 N/F N/F 9.92樣品99 樣品100 樣品101 樣品102 樣品132 88.8 4.728 100 59.6 54.40 35.12 N/F 25.04 25.36 N/F 1.872 0.3336 N/F 2.824 16.48 AFB247.83 75.94 54.64 257.31 4.57 1.647 0.005 0.002 2.147 12.76 AFG12.04 2.544 0.6528 4.464 N/F N/F N/F N/F 0.065 0.1224 AFG236.56 40.08 3.456 N/F 1.72 N/F 1.24 N/F 1.688 1.184 DON 47.12 73.36 1632 145.6 146.4 620 384.8 485.6 583.2 450.4 DON-3G 5.084 242.4 136 110.4 246.4 558.4 112.8 152.8 208.8 125.6 FB1N/F N/F 4216 377.6 64.4 880 210.4 237.6 121.6 1912 FB2N/F 1.168 1380 76.16 27.6 389.6 150.4 57.12 28.88 428 HT-2 6.784 6.16 24.56 5.976 N/F 2.584 12.48 4.176 2.064 3.384 NIV 960.0 N/F N/F N/F 411.2 N/F 297.6 N/F 247.2 N/F OTA 41.76 2.976 14.08 5.248 2.792 2.56 2.76 2.408 2.568 3.400 ST 0.7088 0.4992 5.24 3.20 1.376 2.936 1.760 1.056 1.176 1.632 T2 N/F N/F 1.776 0.2168 0.596 1.976 7.552 3.560 1.264 1.448 ZEN N/F N/F 1360 236.8 N/F 288 108.8 N/F N/F 133.6