雞傳染性支氣管炎病毒的分離與鑒定

趙偉偉 柴書霞

山東省寧津縣畜牧局，山東寧津 253400

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是一種急性和接觸性雞群傳染病，其致病原為雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），該病對雞的傳染性和致病性均很強，肉雞感染后可導(dǎo)致生長緩慢以及飼料利用率下降，蛋雞感染后可導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降，是危害我國養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一[1-2]。2018年10月，山東省寧津縣某蛋雞養(yǎng)殖場發(fā)生了1例以呼吸障礙為主要特征的呼吸道傳染病，為對疫病進行確診，本實驗室利用10日齡SPF雞胚成功分離到了1株雞傳染性支氣管炎病毒，現(xiàn)將整個試驗過程匯報如下。

1 材料與方法

1.1 SPF雞胚

10日齡SPF雞胚購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 臨床診斷

調(diào)查雞場的發(fā)病情況，觀察臨床癥狀，對病死雞解剖，觀察病理變化。

1.3 病料樣品的采集

無菌采集病死雞的氣管、支氣管等病變組織進行實驗室診斷。

1.4 雞胚接種與病變觀察

將采集的臨床病料按1∶3加入滅菌生理鹽水，用研磨器研磨成組織勻漿，離心機12 000 r/min離心5 min，取上清液用0.45 μm的濾器過濾除菌，接種10日齡SPF雞胚10個，接種后24 h照胚，死亡的雞胚棄去，然后每天照雞胚2次，死胚放置4℃保存，待雞胚全部死亡后無菌收集尿囊液，-80℃保存?zhèn)溆茫瑫r觀察死亡雞胚的病變特征。

1.5 分離毒株的血凝試驗

按照常規(guī)血凝試驗方法測定分離毒株對1%雞紅細胞的血凝性。

1.6 分離毒株的RT-PCR檢測

根據(jù)參考文獻[3]對分離毒株進行一步法RTPCR檢測，一步RT-PCR反應(yīng)體系為：2×one Step Buffer 25 μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL、上下游引物 P1、P2（20 μmol/μL）各 1 μL、RNA 10 μL，加水至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：50 ℃ 45 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)，RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳觀察。

1.7 分離毒株的序列分析

將分離毒株的RT-PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，將測序獲得的核苷酸序列與GenBank中登錄的核苷酸序列進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷結(jié)果

該場共飼養(yǎng)蛋雞10 000只，2018年10月開始出現(xiàn)發(fā)病和死亡病例，蛋雞的產(chǎn)蛋率下降，蛋品質(zhì)也下降，發(fā)病雞有300只左右，有60只雞死亡。發(fā)病雞主要表現(xiàn)為咳嗽，呼吸困難，氣管有呼嚕音，打噴嚏，病雞精神沉郁，食欲下降，產(chǎn)蛋下降，產(chǎn)軟殼蛋和畸形蛋，發(fā)病1周左右死亡。對病死雞剖檢可見主要病變部位在氣管和支氣管，氣管和支氣管有出血，有滲出液，蛋雞卵泡充血、出血，鼻腔和鼻竇有漿液性滲出物。綜合發(fā)病情況、臨床癥狀和病理變化，該病例疑似雞傳染性支氣管炎病毒感染。

2.2 雞胚接種與病變觀察結(jié)果

臨床病料樣品接種的10日齡SPF雞胚在接種24～48 h內(nèi)雞胚全部死亡，剖檢死亡雞胚可見胚體蜷縮、矮小，具有“侏儒胚”的典型癥狀。收集死亡雞胚尿囊液作為分離毒株。

2.3 分離毒株的血凝試驗結(jié)果

分離毒株對1%雞紅細胞無血凝性。

2.4 分離毒株的PCR檢測結(jié)果

如圖1所示，分離毒株的RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳可見459 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期大小一致。

圖1 RT-PCR擴增結(jié)果

2.5 分離毒株的序列分析結(jié)果

分離毒株的RT-PCR擴增產(chǎn)物測序后，核苷酸序列比對分析顯示，其為雞傳染性支氣管炎病毒特異性核苷酸序列，證實分離毒株為雞傳染性支氣管炎病毒。

3 討 論

雞傳染性支氣管炎的診斷主要通過臨床癥狀、病理變化等進行初步診斷，確診需要借助實驗室檢測技術(shù)。病毒分離是雞傳染性支氣管炎最經(jīng)典、準確的實驗室診斷方法，且本研究在病毒分離的基礎(chǔ)上借助RT-PCR擴增和序列分析對分離毒株進行鑒定，從分子水平證實分離毒株為雞傳染性支氣管炎病毒，表明引起雞場此次疫病的致病原為雞傳染性支氣管炎病毒，臨床中應(yīng)加強對該病的診斷和防控。由于雞傳染性支氣管炎病毒為病毒病，感染后沒有特效治療藥物，本病主要是預(yù)防為主，養(yǎng)殖場主要通過加強疫苗的免疫接種來預(yù)防本病，本病的疫苗主要是弱毒苗和滅活苗，包括H120和H52兩個毒株，H120的毒力弱，適用于雛雞免疫；H52的毒力強，主要用于20日齡以上雞免疫，滅活苗相對安全，可以用于各種日齡雞免疫，一般是5～7日齡用H120首免，25～30日齡用H52進行二免。雞場預(yù)防本病要做好定期消毒，保持通風(fēng)換氣，注意雞舍的溫度和濕度，平時搞好飼養(yǎng)場衛(wèi)生，增加飼料中多維素的用量，發(fā)病后及時補充鈉和鉀，應(yīng)用抗生素治療，防止繼發(fā)感染。