禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測方法的建立

范俊青 魏燕鳴 鄒 忠 李 冉 孫小美 金梅林,

1.武漢科前生物股份有限公司，武漢 430070；2.華中農業大學動物醫學院，武漢 430070

禽流感是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一種急性呼吸道傳染病，具有傳染性強、傳播速度快、抗原易變異等特點[1]。自2013年春天在長三角地區出現新型H7N9病毒疫情以來，冬春季節交替時人感染H7N9病毒的病例每年都有發生[2-3]。該病毒在我國活禽交易市場及養禽農場的感染范圍不斷擴大，2017年3-6月，在湖南、河北、河南、天津、山西、黑龍江和內蒙古等省份均有家禽感染高致病性H7N9病毒的報道。自疫情暴發以來，約6萬羽家禽感染，30萬羽家禽遭撲殺。多家獸醫機構監測結果均表明，我國H7N9亞型流感病毒的養殖場陽性率和個體陽性率在總體上均呈現逐年上升趨勢，對家禽養殖業和公共衛生安全造成了嚴重威脅[4-5]。國家禽流感參考實驗室采用反向遺傳技術，研制出重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re-1株），通過深入調查研究和專家論證，農業部決定先行在廣東省和廣西壯族自治區對該疫苗進行試點性應用，再進一步在全國范圍內進行推廣，為有效控制H7N9病毒的蔓延奠定了基礎。常規檢測禽流感病毒抗體的方法是血凝抑制（HI）試驗，HI試驗對操作人員的專業素質要求較高，過程繁瑣，對結果判定也有較強的主觀性。因此，研制一種禽流感H7亞型抗體檢測方法對評價疫苗免疫效果和及時監測雞群抗體水平顯得極為重要。

1 材料與方法

1.1 細胞與試驗動物

多發性骨髓瘤細胞（SP2/0）來源于農業微生物學國家重點實驗室，由武漢科前生物股份有限公司保存備用，BALB/c小鼠購于湖北省實驗動物研究中心。

1.2 主要試劑與試劑盒

RPMI-1640 購 自 HyClone，50%PEG1450（P7181）、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG、50×HAT（A：氨基蝶呤）、100×HT（H：次黃嘌呤和 T：胸腺嘧啶核苷）、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、鼠類單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自Sigma公司，青鏈霉素（100×）、胎牛血清購自Gibco公司。禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原，加入2 mL pH值7.4的PBS溶解作為免疫原。

1.3 禽流感病毒H7亞型單克隆抗體的制備

1）按照常規方法進行動物免疫。三免后14 d，尾靜脈采血，間接ELISA測定血清效價。選擇效價最高的小鼠進行加強免疫。免疫后第3天，進行細胞融合。

2）按照常規方法進行細胞融合。采用間接ELISA對雜交瘤細胞上清進行篩選。陽性孔再經過3次有限稀釋法進行亞克隆，待陽性率達到100%時擴大培養，用于制備腹水，并保存于液氮。參照文獻進行腹水的制備，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，離心取上清[6]。

1.4 禽流感病毒H7亞型抗體競爭ELISA檢測方法的建立

1）競爭ELISA抗體檢測方法的初步建立。將獲得的具有競爭效果的單抗純化酶標后，初步建立競爭ELISA抗體檢測方法。

2）特異性試驗。用試制試劑盒分別對5份禽流感病毒H7亞型抗體陰性血清、禽流感病毒H5亞型（AIV-H5）陽性血清、禽流感病毒 H9亞型（AIV-H9）陽性血清、新城疫病毒（NDV）陽性血清、傳染性支氣管炎病毒（IBV）陽性血清、傳染性法氏囊病毒（IBDV）陽性血清進行檢測，根據檢測結果評價其特異性。

3）敏感性試驗。選取6份陽性血清和陽性參考血清從2倍開始倍比稀釋至64倍，分別用3批禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒和HI試驗2種方法檢測。當待檢血清的HI抗體效價稀釋至4log2時（HI試驗判定標準：當HI抗體效價≥4log2，判為陽性；HI抗體效價＜4log2，判為陰性），對應試制試劑盒檢測的PI值應≥40%，以此來評價試制試劑盒的敏感性。

4）與HI試驗符合率比較試驗。與HI試驗同時檢測150份樣品，比較2種方法檢測結果的符合率。

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體的篩選

對陽性雜交瘤細胞株所分泌的上清做競爭效果的篩選，其中陽性血清的OD450nm值用“P”表示，陰性血清細胞上清的OD450nm值用“N”表示，當N/P值越大時，細胞上清的競爭效果越好。試驗結果表明，1H11細胞株所對應的抗體N/P值最大，競爭效果最佳（表1）。

表1 雜交瘤細胞株培養上清競爭效果評價（OD450 nm值）

2.2 競爭ELISA抗體檢測方法的初步建立

使用方陣滴定試驗摸索包被抗原和酶標抗體的稀釋滴度。將抗原按 1∶400、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000 進行稀釋，分別加入到酶標板的第1～8行，每個稀釋度加1行，每孔100 μL。將酶標記抗體按1∶400、1∶600、1∶800、1∶1 000、1∶1 200、1∶1 500 進行稀釋，分別加入酶標板的第1～6列/7～12列，每個稀釋度加1列，每列100 μL。按照競爭ELISA的常規步驟進行操作[7]，方陣滴定結果見表2。當抗原1∶1 000稀釋、酶標記物1∶1 000稀釋時，陽性對照PI值最大，因此，選擇抗原最佳包被濃度為1∶1 000稀釋（每孔抗原包被量含量為2 μg/mL）、酶標記物最佳稀釋倍數為1∶1 000，其N/P值最大（表3）。

表2 方陣滴定結果（OD450 nm值）

表3 方陣滴定的N/P值

2.3 特異性試驗

用試制的禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒檢測5份禽流感病毒H7亞型抗體陰性血清，結果均為陰性（表4）；檢測常見禽病的陽性血清，檢測結果均為陰性（表5），說明該試劑盒與其他常見禽病的陽性血清均無血清學交叉反應。以上結果表明，試制的禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒具有良好的特異性，可用于血清中禽流感病毒H7亞型抗體檢測。

表4 5份禽流感病毒H7亞型抗體陰性血清檢測結果

表5 常見禽病的陽性血清檢測結果

2.4 敏感性試驗

用試制的3批禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒和HI試驗2種方法檢測7份血清。將陽性血清6份和陽性參考血清從2倍開始倍比稀釋至64倍，用HI試驗和試制的試劑盒2種方法分別檢測血清效價，結果基本一致。說明試制的禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒具有良好的敏感性，可以用來檢測禽流感病毒H7亞型抗體（表6）。

2.5 與HI試驗符合率比較試驗

將試制的禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒與HI試驗同時檢測雞血清150份，禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒檢測為陽性28份，陰性122份，HI試驗檢測為陽性27份，陰性123份。試制的試劑盒與血凝抑制試驗相比，符合率為99.3%（表7）。試制的試劑盒與血凝抑制試驗的符合率較高，由此也證實了所研制的試劑盒在檢測雞血清中禽流感病毒H7亞型抗體的可靠性。

3 討論

目前，關于H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的應用相繼有報道，主要是在膠體金試紙條、間接免疫熒光、免疫組化等方面的應用[8-9]。在本研究中，制備了12株特異性針對H7亞型禽流感病毒的單克隆抗體，并通過競爭ELISA方法篩選1株具有較好血凝抑制作用的1H11細胞株，制備并純化得到單克隆抗體，建立了1種應用于評價抗H7亞型禽流感病毒血清抗體水平的競爭ELISA抗體檢測方法，試制了試劑盒。用試制的禽流感病毒H7亞型競爭ELISA抗體檢測試劑盒檢測150份血清樣品，并且與HI試驗進行比較，符合率為99.3%；選取6份禽流感病毒H7亞型HI抗體效價≥9log2和陽性參考血清同時進行敏感性檢測，結果表明試制試劑盒與HI試驗敏感性一致；檢測禽流感病毒H5亞型（AIV-H5）、禽流感病毒 H9亞型（AIV-H9）、新城疫病毒（NDV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）陽性血清均為陰性，檢測已知無禽流感病毒H7亞型感染的血清全部為陰性，證明試劑盒特異性良好。

該方法操作簡便快捷，可批量操作，大樣本檢測雞群抗體水平，為H7禽流感病毒的免疫水平監測提供依據。在我國，高致病性禽流感病毒的免疫防控策略是通過滅活疫苗的免疫維持雞群中高抗體水平，雞群中抗體水平的檢測主要依賴于血凝抑制試驗，對試驗者專業要求高，且工作量大，不利于大規模開展抗體監測。競爭ELISA抗體檢測方法的使用可很好地替代血凝抑制試驗，操作簡便快捷，適用于大規模進行田間檢測H7亞型禽流感病毒的抗體水平，對雞群及時、精準的免疫提供指導意義。

表6 試制試劑盒與HI試驗敏感性比較

表7 與HI試驗符合率結果