虉草適應濕地環境的解剖結構和組織化學特征研究

王曉娥，張梵，張霞，周存宇，楊朝東,2*

(1.長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025;2.長江大學植物生態與環境修復研究所，湖北 荊州 434025)

虉草(Phalarisarundinacea)原產于美國北部，為根狀莖的多年生草本植物[1]，其適應能力強，固土作用明顯，現廣泛分布于世界各地，同時因其營養豐富并作為一種重要牧草[2-3]。近幾十年來，對虉草種類和其對環境變化已深入研究[4-13 ]，而關于虉草的解剖結構特征與適應濕地環境的關系卻未見報道。

濕地植物通常具備以下結構特征適應濕地環境，第一，其根莖中有發達的機械組織抵御水力沖刷，如狗牙根(Cynodondactylon)、雙穗雀稗(Paspalumdistichum)、菰(Zizanialatifolia)等植物的莖作為營養繁殖體，其機械組織為具維管束的厚壁機械組織層和周緣厚壁機械組織層[14-16]。第二是屏障結構保持體內空氣不易擴散出去和控制內外環境離子的進出而防止影響生命活動，屏障結構由初生壁凱氏帶，栓質化和木質化次生壁，體表角質層組成，如狗牙根，雙穗雀稗，藜蒿(Artemisiaselengensis)等植物的莖具木質化和栓質化的厚壁機械組織層和周緣厚壁機械組織層及角質層，或者具內、外皮層，或者具凱氏帶并木質化和栓質化的周皮；不定根具木質化和栓質化的內、外皮層[14-16]。第三是通氣組織為植物在濕地缺氧環境下輸導和儲藏空氣，包括莖中髓腔和皮層氣腔，不定根中通氣組織[14-16]。根際微生物活動為根內通氣組織提供CO2，便于洪水威脅解除后的光合作用[17]。同一物種在不同生長環境，或者不同物種間的形態學、解剖結構和屏障結構的組織化學也存在一定的差異[14-16,18-20]。

虉草5月開花，生長在夏季，一般淹沒于水中10 m左右，秋季和冬季發芽，與江漢洪泛區大部分植物的物候不同[21]。因此，通過對其不定根、根狀莖、直立莖和葉的解剖結構和屏障結構研究，有利于進一步了解其生物學特征，為后續三峽庫區消落帶退化生態系統的修復提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

于2017年3月下旬，自湖北省江漢平原濕地洪泛區采淹沒的虉草植株，用自來水洗凈，取完整不定根；根狀莖長40～60 mm，具3～6個節；直立莖長610～750 mm，具11～13個節，并用FAA固定液固定待用[22]，葉鞘和葉片采用新鮮樣本。用新鮮的不定根、根狀莖和直立莖進行質外體滲透試驗。實驗重復5次。

在立體解剖鏡(JNOEC JSZ6, China)下，用雙面刀片分別在距根尖10和30 mm處，根狀莖第1節間和第3～5節間，直立莖第1節間和第7節間，以及葉的切片。切片用蘇丹紅7B(SR7B)染色，栓質化細胞壁呈紅色[23]，用硫氫酸黃連素-苯胺藍對染(BAB)切片檢測細胞壁木質化和凱氏帶[24-25](凱氏帶呈現生動黃色, 木質化細胞壁呈現呆滯黃色)，鹽酸-間苯三酚-(Pg)檢測木質化，呈櫻桃紅色[10]。用濃硫酸消化切片細胞壁后留下波浪形凱氏帶[26-28]。蘇丹紅7B染色切片在萊卡光學顯微鏡(Leica DME)下觀察，用數碼相機(NIKON E5400, Japan)拍照記錄圖片。硫氫酸黃連素-苯胺藍對染切片在熒光顯微鏡(Olympus IX71)藍色激發光下觀察，用與電腦連接的數碼相機(RZ200C-21,China)拍照記錄圖片，圖片用Photoshop 7.0軟件處理，加標尺，調整圖片亮度和對比度。

不定根、根狀莖和直立莖的質外體通透性試驗步驟如下，取不定根20～30 mm長的片段，用吸水紙吸干，并用粘蠟封口；根狀莖和直立莖樣品切取兩端有節的節間，兩端不封口，實驗5次重復。不定根、根狀莖和直立莖切段浸沒于0.05%硫酸氫黃連素溶液中1 h，再浸沒于0.05 mol·L-1硫氰酸鉀中0.5 h，還包括兩組對照，一是不染色，二是切段僅浸沒于0.05%硫酸氫黃連素溶液中1 h。在立體解剖鏡(JNOEC JSZ6, China)下徒手切片以上處理后的樣品，置于熒光顯微鏡(Olympus IX71)藍色激發光下檢測試驗結果[24,27-28]。

2 結果與分析

2.1 不定根的解剖結構和組織化學

虉草不定根維管柱具6～8個原生木質部(圖1A, B, D和F)和1個中央后生木質部(圖1B, D和F)及周圍具木質化厚壁機械組織(圖1D和F)。距根尖10 mm處，內皮層出現凱氏帶(圖1A)，距根尖30 mm處，外皮層2～3層胞壁具“Y”凱氏帶(圖1B)，內皮層和外皮層同時都栓質化，皮層具通氣組織，表皮未脫落(圖1C)。不定根基部切片，內皮層和外皮層都栓質化和木質化，內皮層“U”形木質化增厚(圖1D, E和F)，皮層具通氣組織，表皮仍存在。

圖1 虉草不定根橫切的顯微照片Fig.1 Photomicrographs of P. arundinacea adventitious root transverse sections A：內皮層凱氏帶(箭頭)，原生木質部，BAB，標尺=50 μm；B：內皮層(箭頭)和外皮層(箭頭)的凱氏帶，后生木質部，BAB，標尺=50 μm；C：完全栓質化內皮層(箭頭)和輕微栓質化外皮層(箭頭)，通氣組織，SR7B，標尺=50 μm；D：內皮層(箭頭)和外皮層(箭頭)凱氏帶，插入圖-凱氏帶之間的切向壁凱氏帶，中柱厚壁機械組織層，BAB，標尺=50 μm；E：內皮層(箭頭)和外皮層(箭頭)栓質化，通氣組織，SR7B，標尺=50 μm；F：內皮層具有“U”形次生壁(箭頭)和外皮層(箭頭)輕微木質化，中柱厚壁機械組織層，Pg，標尺=50 μm；圖中字母縮寫含義：ae，通氣組織；ep，表皮；mx，后生木質部；px，原生木質部；sc，中柱厚壁機械組織；BAB，黃連素-苯胺藍對染；SR7B，蘇丹紅7B染色；Pg，鹽酸-間苯三酚染色。A: Endodermis casparian bands (arrowhead), protoxylem poles, BAB, scale bars=50 μm; B: Casparian bands of endodermis (arrowheads) and exodermis (arrows), metaxylem, BAB, scale bars=50 μm; C: Completely suberized endodermis (arrowhead) and lightly suberized exodermis (arrows), aerenchyma, SR7B, scale bars=50 μm; D: Endodermis (arrowheads) and exodermis (arrows) casparian bands, inset， tangential casparian walls between casparian bands, stele sclerenchyma, BAB, scale bars=50 μm; E: Endodermis (arrowheads) and exodermis (arrows) suberin lamellae, aerenchyma, SR7B, scale bars=50 μm. F: Endodermis with U-shaped secondary walls (arrowheads) and exodermis (arrows) lightly lignified, stele sclerenchyma, Pg, scale bars=50 μm. Abbreviations in figures: ae, aerenchyma; ep, epidermis; mx, metaxylem; px, protoxylem; sc, stele sclerenchyma; BAB, berberine aniline blue stained; SR7B, sudan red 7B stained; Pg, hydrochloric acid-phloroglucinol stained.

2.2 根狀莖和直立莖結構和組織化學

根狀莖尖具維管束厚壁組織層及輕微栓質化和木質化，具氣腔的皮層，具凱氏帶的表皮及外側角質層(圖2A, B)，中央為髓腔。根狀莖第三節間具內皮層，厚壁組織層和周緣厚壁層明顯木質化(圖2C)。根狀莖成熟節間，內皮層具凱氏帶并明顯栓質化和木質化，厚壁組織層和周緣厚壁層強烈栓質化和木質化，皮層具細小栓質化和木質化維管束，皮層氣腔和髓腔擴大(圖2D, E和F)。

圖2 虉草根狀莖(長40～60 mm，具3～6節)在第1節間和第3～5節間橫切的顯微照片Fig.2 Photomicrographs of P. arundinacea rhizomes (40-60 mm long, 3-6 nodes) sectioned at the 1st internode and at 3-5th internode A：第一節間橫切, 表皮外切向壁的角質層，具維管束的厚壁機械組織層({)，髓，皮層氣腔，維管束，皮層，SR7B，標尺=100 μm；B：第一節間橫切，表皮外切向壁的角質層，厚壁機械組織層({)，外皮層凱氏帶(箭頭)，髓，皮層; 插入圖-濃硫酸消化后內皮層凱氏帶(箭頭)，BAB，標尺=100 μm；C：第三節間橫切，表皮外切向壁的角質層，厚壁機械組織層({)，周緣厚壁機械組織層([)，內皮層凱氏帶(箭頭)，皮層，插入圖-濃硫酸消化內皮層凱氏帶， BAB，標尺=100 μm； D：第五節間橫切，厚壁機械組織層栓質化({)，周緣厚壁機械組織層栓質化([)，髓腔，皮層，皮層氣腔，插入圖-內皮層栓質化，SR7B，標尺=100 μm；E：第五節間橫切，厚壁機械組織層強烈木質化({)，周緣厚壁機械組織層([)，皮層具細小維管束，皮層氣腔，髓腔，Pg，標尺=100 μm；F：第五節間橫切，厚壁機械組織層({)，周緣厚壁機械組織層([)，內皮層凱氏帶(箭頭)，皮層，BAB，標尺=100 μm；圖中字母縮寫含義：ca，氣腔；co，皮層；ew，表皮胞壁外角質層；vb，維管束；p，髓腔；PMR，周緣厚壁機械組織層；SCR，厚壁機械組織層；BAB，黃連素-苯胺藍對染；SR7B，蘇丹紅7B染色；Pg，鹽酸-間苯三酚染色。A: 1st internode, cuticle on epidermis outer tangential walls, SCR (brace) with vascular bundles, pith, cortical cavities, vascular bundle, cortex, SR7B, scale bars=100 μm; B: 1st internode, cuticle on epidermis outer tangential walls, SCR (brace), casparian bands on exodermis (arrowheads), pith, cortex, inset-AD of exodermis casparian bands (arrowhead), BAB, scale bars=100 μm; C: 3rd internode, cuticle on epidermis outer tangential walls, SCR (brace), PMR (bracket), casparian bands on endodermis (arrowheads), cortex, upper inset-AD of endodermis casparian bands, BAB, scale bars=100 μm; D: 5th internode, suberin in wide SCR (brace), suberin in PMR (bracket), pith with cavity, cortex, cortical cavities, inset, suberin lamellae of endodermis, SR7B, scale bars=100 μm; E: 5th internode, heavily lignified SCR (brace), PMR (bracket), small cortical vascular bundles, cortical cavities, pith with cavity, Pg, scale bars=100 μm; F: 5th internode, widely SCR (brace), PMR (bracket), casparian bands on endodermis (arrowheads), cortex, BAB, scale bars=100 μm. Abbreviations in figures: ca, cavity; co, cortex; ew, cuticle on epidermal cell wall; vb, vascular bundle; p, pith cavity; PMR, peripheral mechanical ring; SCR, sclerenchyma ring; BAB, berberine aniline blue stained; SR7B, sudan red 7B stained; Pg, hydrochloric acid-phloroglucinol stained.

直立莖尖具維管束厚壁組織層，皮層具葉綠素，具凱氏帶的表皮及外側角質層(圖3A, B)，中央為髓腔。直立莖成熟節間，厚壁組織層和周緣厚壁層強烈栓質化和木質化，皮層和厚壁組織層內部薄壁細胞也栓質化和木質化，皮層氣腔和髓腔擴大(圖3C, D和E)。葉鞘具氣腔，薄壁細胞具葉綠素，外表具角質層(圖3F),葉片葉肉具葉綠素，外表具角質層(圖3G)。

圖3 虉草直立莖(610～750 mm，11～13節)在第1節間和第7節間橫切的顯微照片Fig.3 Photomicrographs of P. arundinacea culms (610-750 mm, 11-13 nodes) sectioned at the 1st internode and at 7th internode A：第一節間橫切，表皮外切向壁上的角質層，厚壁機械組織層({)，維管束，皮層，具葉綠素組織層，皮層，髓腔，SR7B，標尺=100 μm；B：第一節間橫切，外皮層凱氏帶(箭頭)，表皮外切向壁的角質層，BAB，插入圖-濃硫酸消化外皮層凱氏帶(箭頭)，標尺=100 μm；C：第七節間橫切，厚壁機械組織層強烈木質化({)，周緣厚壁機械組織層([)，厚壁機械組織層內部薄壁細胞木質化(*)，Pg，標尺=100 μm；D： 第七節間橫切，厚壁機械組織層木質化({)，周緣厚壁機械組織層([)，厚壁機械組織層內部薄壁細胞木質化(*)，皮層，BAB，標尺=100 μm；E：第七節間橫切，周緣厚壁機械組織層到髓腔的胞壁栓質化(雙向箭頭)，維管束，皮層氣腔，皮層，SR7B，標尺=100 μm；F：葉鞘表皮外切面壁的角質層(箭頭)，皮層或葉肉氣腔，具葉綠素組織層，SR7B，標尺=100 μm；G:葉片表皮外切面壁的角質層(箭頭)，具葉綠素葉肉組織層，SR7B，標尺=100 μm；圖中字母縮寫含義：ca，氣腔；co，皮層；ew，表皮胞壁外角質層；vb，維管束；p，髓腔；chl，具葉綠素組織層；PMR，周緣厚壁機械組織層；SCR，厚壁機械組織層；BAB，黃連素-苯胺藍對染；SR7B，蘇丹紅7B染色；Pg，鹽酸-間苯三酚染色。A: 1st internode, cuticle on epidermis outer tangential walls, SCR (brace), vascular bundle, cortex, chlorenchyma, cortex, pith with cavity, SR7B, scale bars=100 μm; B: 1st internode, casparian bands on exodermis (arrow), cuticle on epidermis outer tangential walls, BAB, inset-AD of exodermis casparian bands (arrowhead), scale bars=100 μm; C: 7th internode, heavily lignified SCR (brace), PMR (bracket), lignified parenchyma cells inside the SCR (*), Pg, scale bars=100 μm; D: 7th internode, lignified SCR (brace), PMR (bracket), lignified parenchyma cells inside the SCR (*), cortex, BAB, scale bars=100 μm; E: 7th internode, suberized cells from PMR extend to pith cavity (two arrows line), vascular bundles, cortical lacuna, cortex, SR7B, scale bars=100 μm; F: Cuticle on the epidermis outer tangential walls of leaf sheath (arrows), cortical or mesophyll cavity, chlorenchyma, SR7B, scale bars=100 μm; G: Cuticle on the epidermis outer tangential walls of leaf blade (arrows), chlorenchyma, SR7B, scale bars=100 μm. Abbreviations in figures: ca, cavity; co, cortex, ew, cuticle on epidermal cell wall; vb, vascular bundle; p, pith cavity; chl, chlorenchyma; PMR, peripheral mechanical ring; SCR, sclerenchyma ring; BAB, berberine aniline blue stained; SR7B, sudan red 7B stained; Pg, hydrochloric acid-phloroglucinol stained.

2.3 不定根、根狀莖和直立莖屏障結構通透性生理

不定根維管柱、內皮層和外皮層有較強自發黃色熒光，而根狀莖和直立莖自發熒光較弱(圖4A, B和C)。僅黃連素處理切段，不定根維管柱、內皮層和外皮層，根狀莖表皮強烈吸收黃連素而具強烈黃色熒光，直立莖仍為自發黃色熒光(圖4D, E和F)。黃連素和硫氰酸鉀處理切段，不定根維管柱、內皮層和外皮層，根狀莖表皮強烈吸收黃連素而具強烈黃色熒光，直立莖仍為自發黃色熒光(圖4G, H和I), 不定根外皮層破裂，內部具硫氰酸黃連素晶體而發強烈黃色熒光(圖4J)。該實驗表明不定根完整外皮層能吸收阻擋離子進入皮層及內部，根狀莖表皮吸收阻擋離子進入，直立莖角質層和表皮完全阻擋離子進入。

圖4 黃連素示蹤不定根﹑根狀莖和直立莖質外體屏障結構的通透性測試Fig.4 Apoplastic barriers permeability tests on roots, rhizomes and culms with berberine tracer 從150 mm長的根選擇根尖40～70 mm長，老根狀莖和直立莖切成含兩節的切段，兩端不封閉，除非另有說明。 A：具通氣組織的不定根，內皮層(箭頭)和外皮層(箭頭)淡黃色，未染色，標尺=50 μm；B：根狀莖表皮呈淡黃色(箭頭)，未染色，標尺=100 μm；C：直立莖表皮呈淡黃色(箭頭)，未染色，標尺=100 μm；D:具通氣組織的不定根，內皮層(箭頭)和外皮層(箭頭)發黃色熒光，具通氣組織的不定根，染色，標尺=50 μm；E：根狀莖表皮發黃色熒光(箭頭)，黃連素染色，標尺=100 μm；F：直立莖表皮發出淡黃色熒光(箭頭)，黃連素染色，標尺=100 μm；G：具通氣組織的不定根，內皮層(箭頭)和外皮層細胞壁(箭頭)呈亮黃色熒光，黃連素和硫氰酸鉀(KSCN)染色，標尺=50 μm；H：根狀莖表皮呈亮黃色熒光(箭頭)，黃連素和硫氰酸鉀(KSCN)染色，標尺=100 μm；I：直立莖表皮呈亮黃色熒光(箭頭)，黃連素和KSCN染色，標尺=100 μm；J：不定根外皮層破裂，通氣組織具硫氰酸黃連素晶體，黃連素和硫氰酸鉀染色，標尺=50 μm。Roots segments sectioned at 40 mm to 70 mm from the tip of 150 mm long roots, the aged rhizome and culm samples excised with one internode and two nodes, and unsealed ends, except where noted. A: Roots with aerenchyma, endodermis (arrowhead) and exodermis (arrow) light yellow, unstained, scale bars=50 μm ; B: Epidermis of rhizomes light yellow (arrowhead), unstained, scale bars=100 μm; C: The epidermis of culms fluoresced light yellow (arrowhead), unstained, scale bars=100 μm; D: Roots with aerenchyma, endodermis (arrowhead) and exodermis cell walls (arrow) fluoresced yellow, berberine stained, scale bars=50 μm; E: The epidermis of rhizomes fluoresced yellow (arrowhead), berberine stained, scale bars=100 μm; F: The epidermis of culms fluoresced light yellow (arrowhead), berberine stained, scale bars=100 μm; G: Roots with aerenchyma, endodermis (arrowhead) and exodermis cell walls (arrow) fluoresced bright yellow, berberine and KSCN stained, scale bars=50 μm; H: The epidermis of rhizomes fluoresced bright yellow (arrowhead), berberine and KSCN stained, scale bars=100 μm; I: The epidermis of culms fluoresced light yellow (arrowhead), berberine and KSCN stained, scale bars=100 μm; J: Roots with ruptured exodermis, crystals of berberine thiocyanate enter into aerenchyma, berberine and KSCN stained, scale bar=50 μm.

3 討論

近些年，主要研究了江漢平原既耐水濕又耐旱生植物的解剖結構和組織化學特征，如狗牙根，雙穗雀稗，牛鞭草(Hemarthriaaltissima)，南方艾蒿(Artemisialavandulaefolia)，藜蒿，天胡荽(Hydrocotylesibthorpioides)，水芹(Oenanthejavanica)，菰，假儉草(Eremochloaophiuroides)，白茅(Imperatacylindrica)，其中水芹不長期淹沒，菰不耐長期旱生，假儉草和白茅以旱生為主，耐短時間水濕環境[14-16,18-19,29-31]。國外主要報道了水稻(Oryzasativa)、蘆葦(Phragmitesaustralis)，水甜茅(Glyceriamaxima)，鳶尾(Iris)，亞馬遜熱帶雨林耐淹沒植物不定根，以及香蒲(Typha)不定根和根莖和水生毛茛(Ranunculustrichophyllus)葉柄的解剖結構和組織化學[20,24,27,32-36]。

虉草不定根解剖結構由外而內分別為：表皮、外皮層、皮層、內皮層、中央為木質部和厚壁機械組織層。其屏障結構由具凱氏帶并栓質化和木質化的內皮層和外皮層組成，與已報道濕地植物狗牙根、雙穗雀稗、白茅、水稻、蘆葦等相同[14-16,18-20,24,27,33,35]，虉草不定根與菰、狗牙根、雙穗雀稗和白茅等都有內皮層鄰近1～2層栓質化和木質化的皮層細胞[14-15, 30]，與香蒲外皮層中的“Y”形凱氏帶結構類似[ 24]，根中厚壁機械組織層與菰類似[15]，這說明虉草與其他適應濕地和干旱環境的植物具相似屏障結構。

虉草莖(根狀莖和直立莖)的結構由外而內分別為：角質層、表皮、周緣厚壁機械組織層、皮層、具維管束厚壁機械組織層和髓腔。其屏障結構為角質層、栓質化和木質化周緣厚壁組織層和厚壁組織層。根狀莖具內、外皮層，直立莖僅具外皮層，而南方艾蒿和藜蒿莖具內、外皮層，天胡荽和香蒲僅具內皮層[16,29,32]。與狗牙根，雙穗雀稗等相比較，都具角質層、栓質化和木質化周緣厚壁組織層和厚壁組織層[14-15]。不同點在于，南方艾蒿和藜蒿莖外側具栓質化和木質化周皮[16]。天胡荽和水芹莖表皮下具厚角組織機械組織[28,31]，雙穗雀稗莖皮層和髓部也具厚角組織[14,18]。假儉草和白茅僅具木質化周緣厚壁組織層[14,30]。此外，水稻胚軸具凱氏帶，水生毛茛葉柄維管束鞘細胞具凱氏帶[34,36]。虉草葉鞘和葉片表面具角質層[3-5,7-9,12,15,21,23]。

虉草體內氣腔包括不定根中通氣組織，莖皮層氣腔和髓腔，及葉鞘氣腔。與狗牙根，假儉草，牛鞭草，水芹，菰，香蒲等體內氣腔類似[14-16,18-20,24,31-33,35,37]。而雙穗雀稗莖皮層和髓部具蜂窩狀通氣組織[14,18]，天胡荽皮層和髓部水濕脅迫后具通氣組織[28]，白茅無髓腔[30]。虉草根中氣腔為裂溶生通氣組織，莖皮層氣腔和髓腔為溶原生性腔，這些通氣組織有助于植物在缺氧環境中把氧氣儲存和運輸到其他器官[38]，是使其能夠適應濕地環境重要的結構特征之一。

根據虉草的屏障結構和解剖結構特點表明，不定根具栓質化和木質化的內皮層和外皮層，莖具角質層、內皮層、外皮層、栓質化和木質化周緣厚壁組織層和厚壁組織層，根和莖葉中具通氣組織是其適應濕地環境的重要結構特征, 為今后選擇合適的物種恢復江漢平原和長江三峽庫區消落帶生態環境具有重要意義[21]。