14份柳枝稷種質資源苗期耐鎘性綜合評價

胡冰鈺，方志剛,2，婁來清，蔡慶生*

(1.南京農業大學生命科學學院, 江蘇 南京210095; 2.喀什大學生命與地理科學學院, 新疆 喀什 844000)

隨著工農業的快速發展，環境中土壤、水體及大氣等受到重金屬不同程度的污染，許多國家和地區由重金屬導致的環境污染問題嚴重，其中以礦區附近農田和邊際土地尤為突出[1-2]。2014年的《全國土壤污染狀況調查公報》表明，中國土壤環境污染狀況嚴重，其中土壤中鎘(cadmium, Cd)的點位超標率最高，達到了7.0%，可能嚴重危及植物的正常生長及人類的健康[3]。目前，我國耕地受到污染的總面積達到2667萬 hm2，其中，由土壤重金屬污染導致的糧食年減產量超過1000萬t[4]。環境中鎘達到一定濃度時可對植物造成毒害作用，抑制植物細胞分裂和光合電子傳遞，擾亂植物體內營養吸收，從而影響植物正常生長[5]，具體表現為葉片失綠，根系發黑，嚴重時甚至導致植株死亡[6]。

已有許多研究證明，不同物種，不同基因型和不同品種間的植物對Cd的吸收及耐受性存在差異，這在水稻(Oryzasativa)[7]、玉米(Zeamays)[8]、花生(Arachishypogaea)[9]等作物中已得到驗證，并為污染土地利用及作物合理生產提供了依據。近年來的研究指出，在重金屬污染土地上種植耐Cd的能源植物可實現生物質資源開發與污染土地利用的雙贏[10-11]。柳枝稷(Panicumvirgatum)是一種多年生草本C4植物，其根系發達，抗旱能力強，適宜生長在邊際土地上，生物質產量高，纖維素含量較高，是典型的草本能源植物[12-14]。另有研究表明，柳枝稷對鎘有較強的耐受性，可在中度和重度Cd污染環境中生長[15-16]。

在鎘污染土壤中種植柳枝稷，既可以充分利用Cd污染土地，又可以獲得其作為轉化生物乙醇的原料，并有利于降低溫室氣體的排放[17]。然而，有關不同柳枝稷種質資源在Cd脅迫下的耐受性差異及系統評估柳枝稷種質資源對Cd脅迫的耐受類型，仍需要進一步的研究。基于此，以能源植物為導向，有必要開展柳枝稷對Cd脅迫耐受性的研究，并結合柳枝稷吸收Cd的特性，為篩選出適宜在Cd污染土地上種植的柳枝稷材料提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

14個柳枝稷品種及生態型見表1，其中3個低地型品種，其余為高地型品種。種子來源于美國 ERNST SEEDS公司。

1.2 試驗設計及方法

種子于50%的硫酸中浸泡20 min打破種子休眠[15]，去離子水沖洗干凈后用10%次氯酸鈉浸泡10 min，再用去離子水沖洗數次，播于培養皿中，萌發后移至洗凈烘干的石英砂上培養，待幼苗長至1葉1心時，移入裝有1 L 1/4 Hoagland營養液的塑料盆(22.0 cm×16.0 cm×7.5 cm) 中，適應生長一周后換為1/2 Hoagland 營養液培養，用HCl或NaOH溶液將營養液的pH調至5.8[18]。待幼苗長至5葉1心時，分別設置對照(0，不加鎘)和10 μmol·L-1CdCl2·2.5H2O處理，每個處理3盆重復，每盆中7棵苗，一周更換兩次營養液，并調換盆缽的位置降低邊緣效應的影響[19]。鎘處理兩周后取樣并測定相關生理指標。植物生長條件為室溫25～30 ℃，濕度50%～70%，光照/黑暗各為12 h。本試驗從2016年9月至2017年3月，在南京農業大學生命科學學院植物環境生理實驗室溫室內進行。

1.3 測定項目及方法

1.3.1根系形態指標的測定 將樣品的地上部和根分離，完整的根系立即放入盛有去離子水的透明盤中，充分分散，使根系無重疊、完整地平鋪在托盤 (30 cm×40 cm) 中。用EPSON掃描儀(Expression 10000XL，日本)掃描，用根系分析軟件(WinRHIZO software V 5.0， Regent Instruments， Quebec， Canada Inc.)分析出總根長、根表面積、根尖數等根系形態參數及根系構型數據。

表1 14個柳枝稷品種及生態型Table 1 Switchgrass cultivars and their ecotype used in the experiment

1.3.2生物量干重和鎘含量測定 將植株放入含有20 mmol·L-1EDTA-Na2溶液的燒杯中浸泡15 min，除去附在根表面的鎘離子，去離子水簡單沖洗后，吸水紙吸干，將植株按根系和地上部分開，于烘箱(101-2A型) 70 ℃下烘干至恒重。樣品Cd含量的測定方法為，取0.1 g烘干樣品放入消煮管中，加入5 mL HNO3，置于高效微波消解系統1 h，消煮后的樣品用2.5%硝酸回溶，定容至25 mL，之后用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-AES)測定植物組織中的Cd含量[20]。

1.3.3凈光合速率的測定 樣品收獲前一天，用便攜式光合測定系統(LI-6400，Li-Cor，Lincoln,NE,美國)測定最新成熟葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)，使用內置紅藍光源(LI-6400-02B)，光強設為1200 μmol·m-2·s-1。樣品室中葉片溫度和二氧化碳濃度分別為(27±2) ℃和(450±10) μmol·mol-1[21]。

1.3.4根系活力的測定 分別稱取上述材料根尖樣品0.5 g，放入15 mL離心管中，加入0.4% TTC (2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10 mL，把根充分浸沒在溶液內，在37 ℃暗保溫1～3 h，然后加入1 mol·L-1硫酸 2 mL，以停止反應。與此同時做一空白實驗，先加硫酸，再加根尖樣品，37 ℃暗保溫后加硫酸，其溶液濃度和操作步驟同上。然后把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3～4 mL和少量石英砂一起在研缽內磨碎，然后將紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌2或3次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10 mL，用分光光度計在波長為485 nm下比色，以空白實驗作參比測出吸光度，查標準曲線即可求出四氮唑還原量[22]，用TTC表示根系活力大小，并根據下式計算根系活力。

TTC(mg·g-1FW·h-1)=C/(1000×W×t)

式中：C為四氮唑還原量(μg)；W為根重(g)；t為時間(h)。

1.4數據分析

1.4.1單項指標耐性指數 為排除不同品種的柳枝稷自身生長情況差異對綜合評價造成的影響，試驗采用耐鎘指數來表述不同材料對鎘脅迫的耐受性[23]。耐鎘指數為鎘脅迫下某一指標測量值與正常情況下該指標測量值的比值。

1.4.2隸屬函數計算 由于不同變量與耐鎘性之間存在正相關和負相關兩種情況，因此，對于與耐鎘性呈正相關的指標，采用正隸屬函數X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，呈負相關的，采用反隸屬函數X(μ)=(Xmax-X)/(Xmax-Xmin)進行計算[24]。式中，X(μ)為柳枝稷某一指標測定值；Xmax為所有植株某一指標同一處理下測定最大值；Xmin為所有植株某一指標同一處理下測定最小值。

1.4.3各綜合指標的權重 運用隸屬函數對各指標進行標準化處理，采用標準差系數法確定各指標權重。

1.4.4各種質材料綜合耐鎘能力的大小 將上式結果代入下面公式，計算得到各種質耐鎘性綜合評價值D。

式中:μ(Xj)表示第j個評價指標的隸屬函數值。

用Excel 2013記錄整理原始數據，SPSS 20.0 統計分析數據，運用Duncan檢驗進行單因素方差分析(P<0.05)。運用隸屬函數法和標準差賦予權重法計算各品種的耐鎘性綜合得分，鑒定每份材料耐鎘能力，并采用歐氏距離的平方系統聚類法進行聚類分析[26]。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對柳枝稷生物量、根系形態及生理指標的影響

如圖1所示，與對照相比，鎘脅迫顯著降低了柳枝稷的根長，根表面積和根尖數，且品種間差異顯著(P<0.01)。就根長而言，Kanlow的下降幅度最低，僅為20%，而Dacotah被抑制的程度最大，達到了76%。在鎘脅迫下，柳枝稷的根干重，地上部干重和總生物量都受到了顯著抑制(P<0.01)(圖2)，但不同品種受抑制程度仍有差異，無論是在鎘脅迫還是對照條件下，Kanlow的總生物量都是最大的，Cd脅迫時該品種總生物量降低了34%，而Longisland的總生物量最小，鎘脅迫下降低了41% (圖2C)。由圖3可以看出，鎘脅迫顯著降低了不同柳枝稷品種的凈光合速率，品種間差異同樣達到顯著水平(P<0.01)，其中，Kanlow的下降幅度最小，僅降低了32%，而Blackwell降低程度最大，為63%；鎘脅迫下，柳枝稷的根系活力也受到顯著抑制(圖4)，且品種間差異顯著(P<0.01)，其中，Kanlow下降的程度最小，只有23%，而Forestburg則降低了55%。

2.2 鎘脅迫下柳枝各單項指標的耐鎘指數

如表2所示，鎘脅迫下，對于根長而言，低地型柳枝稷Kanlow的耐鎘指數最高，高地型Dacotah的最低，且Kanlow的耐鎘指數顯著高于Dacotah(P<0.05)；同樣的，對于凈光合速率而言，Kanlow的耐鎘指數也是最高的，且顯著高于其他品種(P<0.05)，而高地型Cave in Rock的耐鎘指數最小。另外，在鎘脅迫下，各柳枝稷品種根表面積，根尖數，生物量以及根系活力的耐鎘指數均沒有顯著差異。

2.3 柳枝稷耐鎘性綜合評價

如表3所示，柳枝稷耐鎘性綜合評價體系中，凈光合速率，根系活力和總根長的權重最大，分別為0.229, 0.188和0.169，權重加和為體系總權重的58.6%，這表明該評價體系側重于柳枝稷凈光合速率與根系相關參數的評價。采用標準差系數賦予權重法對各種質材料進行綜合評價結果表明，Kanlow的綜合評價值(D)最大，即該品種在鎘處理下耐受性最強，綜合表現最好。根據D值得出各種質的耐鎘性大小依次為 Kanlow>BoMaster>Alamo>Sunburst>Longisland>Shawnee>Trailblazer>Cave in Rock>Carthage>Newyork>Dacotah>Shelter>Blackwell>Forestburg。

采用系統聚類法對D值進行聚類分析，可將14個品種劃分為3類：Kanlow為第一類，屬于強耐鎘型品種；Alamo、Bomaster、Carthage、Cave in Rock、Longisland、Newyork、Shawnee、Sunburst、Trailblazer為第二類，屬于中等耐鎘型品種；Blackwell、Dacotah、Forestburg、Shelter為第三類，屬于鎘敏感型品種(圖5)。

圖1 鎘對柳枝稷根系形態的影響Fig.1 Effect of Cd on root morphology of switchgrass (n=3)

圖2 鎘對柳枝稷干重的影響Fig.2 Effect of cadmium on dry weight of switchgrass (n=3)

圖中數據為平均值±標準誤，下同。Values are means±SE, the same below.**:P<0.01.

圖3 鎘對柳枝稷凈光合速率的影響Fig.3 Effect of cadmium on net photosynthesis rate of switchgrass (n=6)

圖4 鎘對柳枝稷根系活力的影響Fig.4 Effect of cadmium on root activity of switchgrass (n=3)

品種Cultivar根長 Root length根表面積 Root surface area 根尖數Number of root tips總生物量 Total dry weight 凈光合速率 Pn 根系活力Root activity Alamo0.464±0.06ab0.639±0.16a0.512±0.06a0.647±0.05a0.538±0.03ab0.688±0.15aBomaster0.550±0.03ab0.569±0.14a0.632±0.04a0.645±0.10a0.524±0.01bc0.635±0.18aKanlow0.762±0.08a0.680±0.06a0.578±0.02a0.701±0.19a0.680±0.09a0.765±0.11aBlackwell0.306±0.04b0.648±0.15a0.457±0.03a0.702±0.19a0.373±0.05c0.478±0.07aCarthage0.511±0.10ab0.677±0.02a0.407±0.15a0.641±0.25a0.395±0.03bc0.635±0.06aCave in Rock0.381±0.12b0.674±0.14a0.443±0.14a0.733±0.13a0.367±0.02c0.612±0.10aDacotah0.318±0.03b0.700±0.09a0.446±0.09a0.677±0.21a0.410±0.03bc0.532±0.07aForestburg0.435±0.04ab0.616±0.04a0.404±0.03a0.557±0.10a0.442±0.04bc0.503±0.02aLongisland0.534±0.05ab0.584±0.17a0.574±0.12a0.633±0.11a0.462±0.07bc0.605±0.05aNewyork0.483±0.03ab0.448±0.04a0.675±0.12a0.712±0.07a0.370±0.02c0.531±0.03aShawnee0.541±0.18ab0.602±0.24a0.357±0.08a0.667±0.10a0.553±0.04ab0.595±0.04aShelter0.579±0.18ab0.586±0.16a0.474±0.16a0.561±0.23a0.427±0.06bc0.547±0.09aSunburst0.591±0.15ab0.535±0.11a0.615±0.08a0.609±0.11a0.490±0.05bc0.597±0.03aTrailblazer0.532±0.09ab0.586±0.10a0.572±0.06a0.635±0.07a0.465±0.04bc0.493±0.08a

注：數據為平均值±標準誤(n=3)，同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values are means±SE (n=3), different small letters in the same column are significantly different (P<0.05).

表3 鎘脅迫下柳枝稷各指標隸屬函數值、權重、綜合評價值及排序Table 3 Subjective function value, index weight, comprehensive evaluation value (D) and order of switchgrass under Cd stress

注：X1,根長；X2,根表面積；X3,根尖數；X4,總生物量；X5,凈光合速率；X6,根系活力；D,綜合評價值；Wj，各評價指標權重系數。

Note:X1,Root length；X2,Root surface area；X3,Number of root tips；X4,Total dry weight；X5,Pn；X6,Root activity；D,The comprehensive evaluation;Wj, the weighted coefficient of jth evaluation index.

2.4鎘脅迫對柳枝稷根、 葉的鎘含量和鎘富集量的影響

圖5 不同柳枝稷品種耐鎘性分級聚類圖Fig.5 Classified cluster diagram on Cd tolerance of switchgrass

如圖6A所示，中等耐鎘型品種Shawnee根中的鎘含量最高，其次是強耐鎘型品種Kanlow，且這兩個品種的根中鎘含量均顯著高于其余鎘敏感型品種(P<0.05)；而地上部鎘含量最高的是中等耐鎘型品種Newyork，除此之外，強耐鎘型品種Kanlow的地上部鎘含量都顯著高于其他鎘敏感型品種(P<0.05)(圖6B)。對于鎘積累而言，無論根還是地上部，強耐鎘型品種Kanlow的鎘積累量都是最高的，顯著高于其他鎘敏感型品種(P<0.05)(圖6C, D)。鎘是植物生長的非必需元素之一，即使在較低濃度時也可對植物產生毒害，如Cd脅迫加速根尖細胞的衰老，降低根系活力，阻礙根系對營養物質的吸收和向地上部的轉運，導致植株生長受到抑制[27-28]。有研究發現,隨著營養液中Cd濃度的增加，柳枝稷的總根長、根表面積和根尖數顯著降低[16]，本實驗結果與之一致。本研究中柳枝稷的總根長，根表面積，根尖數以及根系活力在10 μmol·L-1鎘脅迫下均顯著降低，且不同品種下降的程度不同，表明這些根系相關參數對Cd脅迫較敏感，故可將根系相關參數作為評估植物耐鎘性的一個重要指標。同樣的，也有研究指出，根系構型變化一般可反映植物對非生物脅迫的敏感程度[29]，因而本研究選用根系形態及根系活力等相關指標來評價柳枝稷的耐鎘性是切實可行的。

圖6 鎘脅迫下柳枝稷根和地上部的鎘含量及積累量Fig.6 Cd concent and accumulation in root and shoot of switchgrass under Cd stress (n=3)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters mean significantly different at P<0.05.

3 討論與結論

鎘脅迫可破壞植物線粒體和葉綠體超微結構，導致呼吸作用和光合作用受到影響[30]，進而植株葉片發黃，生物量下降，干物質量降低[5]。本研究中，鎘脅迫顯著降低了不同柳枝稷品種的生物量干重，張錫洲等[7]的研究表明，鎘脅迫嚴重抑制了水稻的生物量，與本研究結果一致，10 μmol·L-1鎘處理下不同品種柳枝稷的生物量干重也出現了不同程度的降低，因而可將生物量作為評價鎘耐性強弱的另一重要指標。光合作用可用于分析環境因素對植物生長和代謝的影響[31]。鎘脅迫影響了二氧化碳的固定和電子傳遞鏈的發生，從而降低植物光合速率[32]，同樣，本研究中不同品種柳枝稷的凈光合速率在鎘脅迫下也顯著降低，因此可以選用凈光合速率來評價植物耐鎘性。

植物的耐鎘性需要由多指標構成的綜合性指標進行評價[33]，僅憑單個指標評價，其結論不僅可信度低，可能還會自相矛盾，選取多個指標綜合評價植物耐鎘性有利于結論的可靠性，采用隸屬函數法對多個指標進行綜合分析，可以避免單一指標帶來的片面性[34-35]。本實驗評價結果與劉長浩[36]有所不同，這一方面依賴于實驗材料的數量，選取了10個柳枝稷品種，而本實驗有14個，隨著柳枝稷種質材料數量的增加，或許更能篩選出對Cd耐受型極端的材料，另一方面，實驗中僅采用了形態學指標，缺少相關生理指標，而本實驗的評價指標更為全面，除了根系構型和生物量之外，還有凈光合速率和根系活力等生理指標，其中凈光合速率這一指標的權重達到22.9%，說明凈光合速率在評價體系不應被忽視。另有研究通過測定48個番茄品種在低溫脅迫下的相關生理指標，包括與光合作用相關的葉綠素熒光及光系統Ⅱ等參數，采用隸屬函數綜合評價了不同番茄品種耐寒能力，也表明了光合參數在評價體系中的重要性[37]。

本研究通過隸屬函數法對14個柳枝稷種質的6個指標進行綜合評價，結合聚類分析將14個柳枝稷品種分為3個不同的耐鎘型材料，這樣實現了對品種耐Cd性差異的定性分類，但仍需要在今后的大田實驗進一步驗證。聚類分析法也在不同品種多花黑麥草(Loliummultiflorum)種子萌發期耐Cd性差異研究[25]以及篩選不同抗旱性小麥(Triticumaestivum)品種[38]的分析中得到運用，證明該方法具有可行性。

不同植物以及植物的不同部位對Cd的積累能力有一定差異[39]。Sipos等[40]研究發現，Cd主要集中在植物根系，只有少量向地上部轉移。本實驗中14個柳枝稷材料幼苗的根部鎘含量均大于地上部，這表明根向地上部轉移鎘的能力較低，減少重金屬從根向地上部的運輸是植物耐受重金屬脅迫的機制之一[41]。其中耐鎘性強的品種Kanlow體內的鎘含量高，鎘積累量大，表明耐鎘性強的品種具有更高的鎘富集能力。該品種可能更適合種植于鎘污染土地上，作為能源植物應用潛力巨大。