惡性黑色素瘤的黑色素含量與其進展和轉移相關性探討*

楊鈺瑩 劉莉 折虹 柯亨寧②

惡性黑色素瘤為最具侵襲性的癌癥之一，雖然占所有皮膚惡性腫瘤的比例不足5%，但死亡率極高［1-2］。所以惡性黑色素瘤的早期識別與診斷顯得尤為重要。黑色素是由黑色素細胞中的酪氨酸經過一系列酶催化反應合成。據文獻報道，皮膚及虹膜黑色素瘤組織中黑色素沉著的減少與較差的預后包括生存率下降有關［3-4］。但是尚無黑色素含量與腫瘤進展和臨床分期的相關性的報道。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是細胞從G1期至S期的調節蛋白［5］，在乳腺癌、皮膚惡性黑色素瘤、子宮內膜癌和結直腸癌等多種惡性腫瘤中檢測到cyclin D1異常增高［6］。本研究采用組織芯片的免疫組織化學（immunohistochem-istry，IHC）染色方法檢測黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表達，并分析其與臨床病理指標之間的關系，闡明其在惡性黑色素瘤中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

檢測購于西安艾麗娜生物有限公司189例惡性黑色素瘤患者組織中的黑色素含量和cyclin D1表達（126例原發病灶，63例轉移病灶）。包括男性92例和女性97例，年齡7～88歲（平均53.6歲，標準差13.5歲）。其中，126例原發性惡性黑色素瘤的病例包括91例（72.2%）皮膚惡性黑色素瘤和35例（27.8%）黏膜惡性黑色素瘤。根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）黑色素瘤分期系統，12例（13.2%）、69例（75.8%）、8例（8.8%）和2例（2.2%）患者分別被診斷為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期皮膚惡性黑色素瘤。黏膜惡性黑色素瘤因現有臨床標準不統一而未分期。取材后將病理組織用4%多聚甲醛溶液固定并用石蠟包埋，然后將樣本制成組織芯片。由兩位病理專家通過H&E染色、HMB45和S100的IHC對病理組織做出最終特異性診斷。惡性黑色素瘤的組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司。該研究經寧夏醫科大學總醫院倫理委員會批準并獲得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 IHC 本研究中采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）方法進行IHC染色。標本切片在60℃烤片1 h，脫蠟、水化、蒸餾水清洗和抗原修復。在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中洗滌后，室溫下用3%H2O2覆蓋組織10 min。PBS洗滌后用10%正常山羊血清ZLI-9022，購自中杉金橋生物技術有限公司，在37℃下封閉1 h。滴加一抗cyclin D1為1∶150；兔抗人單克隆抗體ab134175，購自美國Abcam公司，4℃孵育過夜。隔日，將切片用PBS沖洗后滴加生物素標記的羊抗兔IgG抗體，37℃孵育20 min；PBS再次洗滌后孵育鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液KIT-9710，購自福州邁新生物技術有限公司。采用3-氨基-9-乙基-1-咔唑（3-amino-9-ethyl-1-carboazole，AEC）顯色15 min，蘇木精復染，直接用水性封片劑封片。PBS代替一抗作為陰性對照。cyclin D1實驗片和陰性對照片顯微鏡下同時可以觀察黑色素的含量。

1.2.2 病理形態計量學分析 由兩名病理醫生采用雙盲法對切片進行評估和IHC評分。參照Weichert等［7］研究方法，通過半定量評分系統評估cyclin D1的IHC染色，黑色素含量也參照下述評分方法評估。陽性腫瘤細胞的染色強度分為0分（無染色）、1分（淺紅色）、2分（紅色）和3分（深紅色）。陽性腫瘤細胞的比例分為0分（無染色）、1分（≤10%）、2分（11%～50%）、3分（51%～80%）和4分（＞80%）。腫瘤細胞的染色陽性強度和陽性細胞比例相乘后最終的IHC評分為0～12分。其中0～4分為低表達，5～12分為高表達。使用Aperio Image Scope軟件和Olympus BX51顯微鏡，在400倍放大倍率下觀察每個樣品至少3個區域。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析。計數資料組間差異的比較采用χ2檢驗或連續校正χ2檢驗，計量資料組間差異的比較采用U檢驗，相關關系使用Spearman相關性分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黑色素含量與黑色素瘤TNM分期關系

本研究結果顯示，189例腫瘤樣本中，黑色素高含量者76例，無或低含量者113例。黑色素含量與腫瘤的侵襲深度和臨床分期有關，而與患者的年齡、性別、腫瘤組織來源和有無淋巴結轉移無關（P＞0.05）；T1、T2期黑色素瘤中的黑色素含量明顯高于T3、T4期（χ2=8.316，P=0.004，表1）。采用U檢驗分析發現Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中的黑色素含量明顯高于Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤（P=0.038，圖1A）。將IHC評分作為計量資料，采用U檢驗得到同樣的結果（P=0.001，圖1B）。腫瘤細胞的細胞質、細胞核以及間質區域均可見大量的黑色素沉著，呈棕褐色或黑色（圖2，3），部分遮蓋了組織結構和細胞形態。本研究結果提示，黑色素含量可能隨著腫瘤的侵襲和進展而降低。

表1 黑色素含量和cyclin D1表達在惡性黑色素瘤中與臨床病理指標的關系

表1 黑色素含量和cyclin D1表達在惡性黑色素瘤中與臨床病理指標的關系（續表1）

2.2 cyclin D1表達

cyclin D1蛋白主要表達于腫瘤細胞的細胞核中，著色細胞呈紅色（圖2，3），在部分腫瘤細胞的細胞質中也可見陽性染色。189例腫瘤樣本中，14例（9例原發病灶、5例轉移病灶）因黑色素遮蓋腫瘤細胞無法做出IHC陽性判讀，其余175例cyclin D1高表達者80例，低表達者95例。cyclin D1表達與年齡、性別、侵襲深度、臨床分期、有無淋巴結轉移和腫瘤組織來源無關，差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

2.3 惡性黑色素瘤組織中的cyclin D1表達與黑色素含量的相關性分析

在175例腫瘤標本中，采用Spearman相關性分析發現黑色素的表達和cyclin D1陽性表達呈負相關，差異無統計學意義（r=-0.144，P=0.057，圖4A）。然而，黑色素的含量和cyclin D1表達在58例淋巴結轉移性惡性黑色素瘤中呈負相關，差異具有統計學意義（r=-0.271，P=0.039，圖4B）。結果提示，黑色素在轉移性黑色素瘤中降低可能與腫瘤細胞的增殖加快和轉移有關。

圖1 黑色素在皮膚黑色素瘤中的含量

圖2 原發性惡性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表達（IHC×400）

圖3 淋巴結轉移性惡性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表達（IHC×400）

圖4 惡性黑色素瘤組織中cyclin D1表達與黑色素含量的相關性分析

3 討論

黑色素瘤細胞為來源于黑色素細胞的惡性腫瘤細胞。合成黑色素為正常黑色素細胞的功能，黑色素的產生在名為黑素體的特定卵圓形細胞器中。在黑素體內合成的黑色素通過樹突轉運到鄰近的角質形成細胞，并在角質形成細胞和黑色素細胞的核周區域積累，被認為可以保護DNA免受紫外線的損傷［8］。黑色素細胞惡變后產生黑色素的功能、黑色素的代謝以及其病理意義研究較為有限。

本研究結果顯示，189例惡性黑色素瘤患者組織中的黑色素高含量者為76例（40.2%）。黑色素含量與患者的年齡、性別、腫瘤組織來源和有無淋巴結轉移無關，與腫瘤的侵襲深度（P=0.001）和臨床分期（P=0.038）有關，提示黑色素含量可能隨著腫瘤的侵襲和進展而下調。目前，國內外關于黑色素含量與惡性黑色素瘤的分期和轉移相關性的研究報道較少。Moreau等［3］分析了2000年至2009年美國18個州的侵襲性黑色素瘤病例，研究發現無色素性黑色素瘤的5年生存率（overall survival，OS）明顯低于有色素性黑色素瘤。Brouwer等［4］在444例結膜黑色素瘤中使用單變量和多變量回歸分析研究了虹膜顏色、膚色和腫瘤色素沉著與臨床參數和結果之間的關系，發現腫瘤低色素沉著與轉移形成有關，且這類患者預后較差。Brozyna等［9］分析了黑色素瘤患者的OS和無病生存期（disease-free survival，DFS）與腫瘤色素沉著程度的關系，發現在患有轉移性疾病的患者中，無黑色素沉著患者的DFS和OS短于黑色素沉著患者。上述研究缺乏黑色素含量的半定量和進一步研究。本研究與上述研究的差異為：1）本研究在病理切片中將黑色素含量根據鏡下觀察進行半定量，而上述研究無；2）本研究首次將黑色素含量與臨床分期進行相關性分析，而非分析具體指標相關性；3）本研究還發現淋巴結轉移黑色素瘤中黑色素含量與cyclin D1的表達呈負相關。本研究的局限性在于因為缺失隨訪數據而未作生存率分析，但是現有研究結果表明無或低色素沉著的腫瘤多為惡性程度較高的Ⅲ、Ⅳ期，該結果間接提示無或低黑色素含量的患者預后可能不良。

cyclin D1作為細胞周期的關鍵調節分子，在多種腫瘤中發現其過表達可致細胞增殖失控［10］。Oba等［11］采用IHC法檢測78例原發性黑素瘤、24例轉移性病灶和42例良性痣中cyclin D1的表達，結果顯示原發性黑素瘤中cyclin D1的表達明顯高于良性痣，cyclin D1陽性率在原發性黑色素瘤中的比例高于轉移性黑色素瘤。但是這與另外兩項研究結果不一致，Georgieva等［12］研究發現，cyclin D1表達與組織病理學分期無關。Oba等［11］研究發現，Breslow深度和cyclin D1表達水平無關系，所有原發性黑素瘤的cyclin D1表達水平與轉移的存在并無關。cyclin D1表達并不能預測淺表和原發性結節性黑素瘤的DFS或OS［11-13］。上述研究結果表明，cyclin D1在原發性黑素瘤轉移的進展過程中作用存在爭議。本研究結果顯示，cyclin D1的表達與年齡、性別、侵襲深度、臨床分期、有無淋巴結轉移和腫瘤組織來源無關，與上述部分研究結論相一致。黑色素的含量與cyclin D1的表達在淋巴結轉移性惡性黑色素瘤中呈負相關，提示黑色素的降低可能參與轉移瘤細胞的增殖。

在臨床病理診斷中，IHC染色為不可或缺的環節。在過氧化物酶法染色過程的最后一步通常會使用IHC染色劑3，3-二氨基苯聯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，其終產物呈棕色。然而，黑色素的顏色也是棕色或黑色，且黑色素屬于組織內源性色素，標本經常規固定、脫水、透明、浸蠟和包埋等一系列處理后，黑色素依然存于組織中。針對黑色素干擾病理診斷的問題，研究者會使用強氧化劑將黑色素脫色后再進行后續的IHC染色和診斷［14］。通過脫色素方法雖然能夠將覆蓋于組織的大部分色素脫去，但是同時黑色素的重要價值也被忽略。本研究中使用的IHC顯色劑AEC終產物顏色為紅色［15］，在顯微鏡下可以明顯的與黑色素區分，故在同一張切片上可以同時對黑色素和cyclin D1進行判讀。由于既往對于黑色素的診斷意義缺少認識，病理組織中黑色素含量易被忽略。本研究結果顯示，采用組織切片預估黑色素含量是必要且可行的，對于黑色素瘤的預后判斷是有意義的。未來亟需黑色素含量與黑色素瘤患者OS的關系以及黑色素沉著機制與腫瘤生長和侵襲的進一步研究。此外，如果患者的病理組織表現出低黑色素含量和cyclin D1高表達，結合其他臨床檢驗結果預估腫瘤惡性程度較高，預后不良，手術應盡早切除并進行可疑淋巴結清掃。

綜上所述，黑色素含量與惡性黑色素瘤的侵襲和進展相關，cyclin D1在惡性黑色素瘤中的表達與臨床病理指標之間無顯著性差異，但是在淋巴結轉移性黑色素瘤中，cyclin D1的表達與黑色素含量呈負相關，其結合在指導惡性黑色素瘤的病理診斷和預后分析方面可能具有重要意義。