骨膜蛋白表達與腎透明細胞癌患者預后的關系

姜賢　涂紅堅　劉斌　諶輝鵬　羅慶華　曹雷華　熊雯紅

【摘要】 目的：探究骨膜蛋白表達與腎透明細胞癌患者預后的關系。方法：選取2012年1月-2014年1月于本院接受根治性腎切除術的腎透明細胞癌患者118例，失訪11例，以腎癌骨膜蛋白相對表達量中位數（1.12）為界分為高表達組（≥1.12）50例和低表達組（<1.12）57例。采用免疫組織化學法觀察兩組患者骨膜蛋白陽性表達情況，采用Western blot檢測兩組患者骨膜蛋白表達情況，分析骨膜蛋白表達與臨床病理參數及術后生存率的關系。結果：骨膜蛋白高表達組的腫瘤直徑>7 cm、腫瘤低分化、淋巴轉移患者例數均顯著多于骨膜蛋白低表達組，差異均有統計學意義（P<0.05）。骨膜蛋白高表達組POSTN表達相對表達量顯著降低于骨膜蛋白低表達組，差異有統計學意義（t=29.933，P=0.000）。免疫組化結果顯示，高表達組骨膜蛋白陽性表達率顯著高于低表達組，差異有統計學意義（字2=22.202，P=0.000）。骨膜蛋白低表達組1年生存率為91.20%，高于高表達組的76.00%，差異有統計學意義（P<0.05）;骨膜蛋白低表達組5年生存率為43.86%，高于高表達組的20.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：骨膜蛋白表達與腎透明細胞癌患者腫瘤大小、病理分級、臨床分期、總體生存率密切相關。

【關鍵詞】 腎透明細胞癌 骨膜蛋白 預后

Relationship between Periostin Expression and Prognosis of Patients with Renal Clear Cell Carcinoma/JIANG Xian， TU Hongjian， LIU Bin， CHEN Huipeng， LUO Qinghua， CAO Leihua， XIONG Wenhong. //Medical Innovation of China， 2019， 16（29）： 00-004

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between periostin expression and prognosis of patients with renal clear cell carcinoma. Method： A total of 118 patients with renal clear cell carcinoma who underwent radical nephrectomy in the hospital from January 2012 to January 2014 were enrolled， and 11 cases were lost to follow-up. With the median relative expression of periosteal protein （1.12） as the boundary， 50 patients in the high expression group （≥1.12） and 57 patients in the low expression group （<1.12） were divided into two groups. The positive expression of periosteal protein in the two groups was observed by immunohistochemistry， and the expression of periosteal protein in the two groups was detected by Western blot， and the relationship between periosteal protein expression and clinicopathological parameters and postoperative survival rate was analyzed. Result： The number of patients with > 7 cm tumor diameter， low differentiation and lymph node metastasis in the periosteal protein high expression group were significantly more than those in the periosteal protein low expression group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The relative expression of POSTN in the periosteal protein high expression group was significantly lower than that in the periosteal protein low expression group， the difference was statistically significant （t=29.933， P=0.000）. Immunohistochemical results showed that the positive expression rate of periosteal protein high expression group was significantly higher than that in the periosteal protein low expression group， with statistically significant difference （字2=22.202， P=0.000）. The 1-year survival rate of the periosteal protein low expression group was 91.20%， higher than 76.00% of the periosteal protein high expression group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The 5-year survival rate of periosteal protein low expression group was 43.86%， higher than 20.00% of periosteal protein high expression group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Periosteal protein expression is closely related to tumor size， pathological grade， clinical stage and overall survival rate in patients with renal clear cell carcinoma.

[Key words] Renal clear cell carcinoma Periostin Prognosis

First-authors address： The Third Hospital of Nanchang， Nanchang 330029， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.29.001

腎癌（renal cell carcinoma）又稱腎細胞癌、腎腺癌，是泌尿系第二大惡性腫瘤，占原發性腎惡性腫瘤的85%左右[1]。近年來腎癌的發病率呈升高的趨勢。腎癌的癥狀早期不明顯，其轉移方式主要是淋巴和血行轉移[2]。腎癌與吸煙、肥胖、長期血液透析、長期服用解熱鎮痛藥物等有關[3]。目前腎癌主要依靠影像學提供最直接的診斷依據[4]。根治性腎切除術是治療局限性腎癌公認的方法[5]。骨膜蛋白（periostin，POSTN）是相對分子質量約為93 300的多功能同源二聚體糖蛋白[6]。李萍等[7]研究表明，乳腺癌組織POSTN mRNA表達水平顯著高于癌旁組織和正常乳腺組織。柯毓敏等[8]研究表明，注射POSTN陽性細胞裸鼠的腫塊重量、體積及瘤體POSTN陽性表達均顯著高于注射POSTN陰性細胞的裸鼠。郭康[9]研究表明，POSTN在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。目前有關POSTN與腎癌及腎透明細胞癌患者預后研究較少。本文旨在研究POSTN表達與腎透明細胞癌患者預后的關系，以期了POSTN的表達與腎透明細胞癌患者預后的關系，從而為腎癌預后判斷提供一定的理論依據，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月-2014年1月于本院接受根治性腎切除術的腎透明細胞癌患者

118例，失訪11例，隨訪成功107例，其中男70例，女37例;體質量41～82 kg，平均（50.20±8.05）kg;年齡38～75歲，平均（66.01±10.25）歲;病理分期采用美國癌癥聯合委員會（AJCC）2002年第6版的標準進行腎癌的TNM：T1期35例，T2期30例，T3期22例，T4期20例;其中發生淋巴結轉移58例，無淋巴轉移49例。納入標準：（1）所有患者診斷均符合2005年腎透明細胞癌的CT、MRI診斷標準[10];（2）近期未服用精神病藥物;（3）患者精神正常;（4）患者臨床資料完整。排除標準：（1）近3個月內有腹部手術史;（2）隨訪數據不完整;（3）孕婦或哺乳期婦女。該研究已經醫院倫理學委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 藥物與試劑 骨膜蛋白抗體購自Santa Cruze Biotechnology公司;磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司。

1.2.2 儀器 低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司;光學顯微鏡購自東莞市同創儀器有限公司;切片機購自德國Leica公司;蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2.3 隨訪情況 采用回顧性研究的方法，摘錄患者的臨床資料和實驗室檢查信息，以患者住院確診為腎透明細胞癌時的臨床及生化資料為研究資料，對研究對象進行電話隨訪，直至患者死亡或研究結束。以腎癌骨膜蛋白相對表達量中位數（1.12）為界分為：高表達組（≥1.12）50例和低表達組（<1.12）57例。

1.2.4 免疫組化檢測蛋白表達水平 將組織切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ，95%、85%、75%乙醇中，10 min/次。使用PBS沖洗3次，5 min/次。室溫下孵育10 min，后使用蒸餾水、PBS分別沖洗3次，5 min/次。使用EDTA組織抗原修復液高壓熱修復后使用蒸餾水和PBS分別沖洗3次，2 min/次，去多余PBS，滴加正常山羊血清封閉液至切片，室溫放置20 min，滴加稀釋200倍的Ⅰ抗，置濕盒于4 ℃過夜。使用PBS洗3次，2 min/次。滴加生物素化二抗，在37 ℃孵育20 min，使用PBS洗3次，2 min/次。滴加DAB顯色劑，蘇木素復染，充分水洗，鹽酸酒精分化，水洗返藍。使用酒精梯度脫水，置入二甲苯中透明，最后用中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以β-actin為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗或者Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 隨訪結果 至研究結束，共發生死亡事件72例，35例患者存活，11例失訪（失訪原因為電話號碼改變、地址發生變動等）。本研究失訪率為9.32%（11/118），死亡率為67.29%（72/107），存活率為32.71%（35/107），隨訪時間為1～1 825 d，中位數為913 d。

2.2 腎透明細胞癌患者骨膜蛋白表達水平與臨床病理參數關系 POSTN高表達組和低表達組患者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。骨膜蛋白高表達組的腫瘤直徑>7 cm、腫瘤低分化、淋巴轉移患者例數均顯著多于骨膜蛋白低表達組，差異均有統計學意義（P<0.05）。骨膜蛋白低表達組的腫瘤分期情況好于骨膜蛋白高表達組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 Western blot檢測骨膜蛋白表達情況 骨膜蛋白高表達組POSTN表達相對表達量（2.00±0.25），顯著降低于骨膜蛋白低表達組的（0.75±0.18），差異有統計學意義（t=29.933，P=0.000），見圖1。

2.4 免疫組化檢測骨膜蛋白蛋白表達水平 免疫組化結果顯示，高表達組骨膜蛋白陽性表達例數為30例（60.0%），低表達組為6例（10.53%），高表達組骨膜蛋白陽性表達率顯著高于低表達組，差異有統計學意義（字2=22.202，P=0.000）。

2.5 腎透明細胞癌患者骨膜蛋白表達水平對患者生存率的影響 骨膜蛋白低表達組1年生存率為91.20%，高于骨膜蛋白高表達組的76.00%，差異有統計學意義（P<0.05）;骨膜蛋白低表達組5年生存率為43.86%，高于骨膜蛋白高表達組的20.00%，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

POSTN是一種細胞外基質分泌蛋白，具有4個重復成束蛋白結構域;最早發現于小鼠成骨細胞系中，是從小鼠成骨細胞系中克隆的一種骨黏附分子[11]。早期研究POSTN是其在腫瘤病理進程中的作用。近年來隨著對其研究的加深，發現POSTN在許多組織中都有表達，尤其在富含膠原的組織中含量較高。趙佐芳等[12]研究表明，POSTN與腫瘤惡性程度及轉移有著密切的關系。王文榮等[13]研究表明，POSTN不僅參與腎臟疾病的病理過程，同時也參與腎小球疾病、糖尿病腎病、多囊腎等多種腎臟疾病的病理過程，且其表達水平與疾病發生發展和預后有密切關系。在正常成人腎臟組織中POSTN極少表達，在腎癌患者腎臟組織內POSTN表達明顯升高，且與腎功能下降呈正相關。

本研究中將腎癌患者分為POSTN高表達組和POSTN低表達組，結果顯示，在POSTN高表達組中，患者腫瘤直徑>7 cm比例顯著高于低表達組（P<0.05），說明POSTN對腫瘤的生長有一定的影響，POSTN表達與腫瘤質量呈正相關。韓林[14]研究表明，POSTN高表達患者腫瘤直徑大于POSTN低表達患者，與本研究得出的結論相一致。本研究中發現，在POSTN高表達組中，腫瘤分期T3、T4患者例數顯著多于POSTN低表達組（P<0.05）。說明POSTN的表達與腫瘤分期呈密切關系，且POSTN的表達與腫瘤分期呈正相關。隨著腫瘤分期的進展POSTN的表達隨之增高。曹宇等[15]研究表明，POSTN高表達患者腫瘤TNM分期有密切關系，與本研究得出的結論相一致。本研究中發現，在POSTN高表達組中，腫瘤低分化的患者例數顯著多于POSTN低表達組（P<0.05）。說明POSTN與腫瘤的分化關系密切，且腫瘤分化程度越低POSTN表達越高。李群等[16]研究表明，腫瘤分化程度越低POSTN表達越高，與本研究得出的結論相一致。本研究中發現，在POSTN高表達組中，患者總生存率顯著低于POSTN低表達組（P<0.05）。說明POSTN與腎癌患者術后生存率密切相關，且POSTN表達越高，患者術后生存率越低。胡飛等[17]研究表明，POSTN表達與癌癥患者治療后生存率呈負相關，與本研究得出的結論相一致。

綜上所述，POSTN表達水平較高的患者腫瘤直徑較大、腫瘤分化較高、淋巴轉移較多、術后5年生存顯著降低。

參考文獻

[1] Hsieh J J，Purdue M P，Signoretti S，et al.Renal cell carcinoma[J].Nature Reviews Disease Primers，2017，9（3）：17009.

[2] Huang Q，Sun Y，Ma X，et al.Androgen receptor increases hematogenous metastasis yet decreases lymphatic metastasis of renal cell carcinoma[J].Nature Communications，2017，8（1）：918.

[3] Ito R，Narita S，Huang M，et al.The impact of obesity and adiponectin signaling in patients with renal cell carcinoma： A potential mechanism for the “obesity paradox”[J].PLoS One，2017，12（2）：e0171615.

[4] Song J N，Zhao X Z，Lian H B，et al.Mid-term follow-up results of laparoscopic radiofrequency ablation for renal cell carcinoma of T1aN0M0 stage[J].Zhonghua Wai Ke Za Zhi [Chinese Journal of Surgery]，2013，51（4）：320.

[5] Gershman B，Thompson R H，Boorjian S A，et al.Radical Nephrectomy With or Without Lymph Node Dissection for High-Risk Non-Metastatic Renal Cell Carcinoma： A Multi-Institutional Analysis[J].Journal of Urology，2017，197（4）：e737.

[6] Chuanyu S，Yuqing Z，Chong X，et al.Periostin promotes migration and invasion of renal cell carcinoma through the integrin/focal adhesion kinase/c-Jun N-terminal kinase pathway[J].Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology & Medicine，2017，39（4）：1010428317694549.

[7]李萍，王熙才，劉洪璐，等.骨膜蛋白在乳腺癌中的表達及其臨床意義[J].中國腫瘤生物治療雜志，2017，24（11）：1293-1298.

[8]柯毓敏，周云清，吳珠娜.骨膜蛋白在子宮內膜癌的腫瘤干細胞中裸鼠成瘤性的實驗研究[J].中國臨床藥理學雜志，2015，23（1）：2329-2332.

[9]郭康.Periostin、E-cadherin及Nanog與胃癌術后復發轉移的相關性分析[D].鄭州：鄭州大學，2014.

[10]韓希年，彭令榮，劉光華，等.腎透明細胞癌的CT、MRI診斷[J].中國醫學影像技術，2005，3（5）：776-778.

[11]張衡，武琳琳，李世杰，等.混合譜系激酶結構域樣蛋白在小鼠妊娠早期子宮及蛻膜中的表達及調控[J].第二軍醫大學學報，2018，39（10）：64-69.

[12]趙佐芳，劉英，王大慶.骨膜蛋白在腫瘤中的作用研究進展[J].重慶醫學，2016，45（32）：4581-4584.

[13]王文榮，趙世杰，安惠霞.骨膜蛋白與腎臟病的相關研究[J].中國中西醫結合腎病雜志，2018，19（10）：92-94.

[14]韓林.骨膜蛋白基因表達與骨肉瘤預后相關性[J].中華實用診斷與治療雜志，2017，31（8）：754-756.

[15]曹宇，董文亮，劉亮，等.骨膜蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義[J].中國醫科大學學報，2017，46（7）：628-631.

[16]李群，關為群，張楊安，等.骨膜蛋白和p53在口腔白斑及鱗狀細胞癌組織中的表達及意義[J].國際口腔醫學雜志，2019，46（1）：5-11.

[17]胡飛，張繼學，王偉，等.骨膜蛋白在骨肉瘤組織中的表達及臨床意義[J].安徽衛生職業技術學院學報，2014，3（6）：93-95.

（收稿日期：2019-04-04） （本文編輯：張爽）