纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)涂覆型手性固定相的制備研究與分離應用

吳海波，薛興亞，李奎永，周永正*

(1.浙江華譜新創科技有限公司，浙江 溫嶺 317503；2.中國科學院 大連化學物理研究所 分離分析化學重點實驗室，遼寧 大連 116023)

多糖衍生物手性固定相是目前應用最廣泛的一類手性固定相。據統計，其應用占據了手性分離案例中的90%。此類固定相最早由日本的Okamoto研究組開發并實現商品化，主要由直鏈淀粉或纖維素的衍生物通過涂覆或鍵合到大孔硅膠上制得。其主要分離原理是基于多糖衍生物高度有序的螺旋結構提供了復雜多樣的手性環境，從而可與不同構型對映體發生選擇性的作用[1-3]。

目前，由直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)，纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)和直鏈淀粉-三[(S)-α-甲基芐基氨基甲酸酯]分別涂覆制備的AD、OD、OJ和AS柱是選擇性最強的4款手性柱[4-6]。由于合成原料簡單、易得，纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)(CTMB)涂覆的固定相成為眾多研究的對象[7-9]，在手性制備分離上顯示了很大的應用潛力。但不同于多糖氨基甲酸酯型衍生物，多糖酯型衍生物由于缺乏分子內氫鍵作用而導致其晶型結構不穩定，易受涂覆溶劑體系的影響。因此，許多研究發現涂覆溶劑中添加三氟乙酸、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯等添加劑會對此類固定相的選擇性產生較大影響[10-12]。

多糖衍生物涂覆型固定相一般選擇氨基化的大孔硅膠作基質。但氨基硅膠自身穩定性較差，另外氨基可能會對化合物產生較強的非對映選擇性作用，從而削弱固定相的選擇性[13]。本文選擇C8硅烷修飾的大孔硅膠作基質，研究了CTMB固定相涂覆時，以氯仿或二氯甲烷作溶劑，分別添加N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯、苯乙酮對選擇性的影響，并考察了固定相在手性制備分離上的應用。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜為Waters 515泵系統，配7725i手動進樣器、2489檢測器(美國Waters公司)；Elementar Vario EL Ⅲ元素分析儀(德國Elementar Analysensysteme公司)；裝柱機、不銹鋼空柱管(250 mm×4.6 mm i.d.)由大連思譜精工有限公司提供。

實驗所用球形硅膠，平均粒徑5 μm，孔徑1 000 ?，比表面積25 m2/g(浙江華譜新創科技有限公司)；微晶纖維素(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；4-甲基苯甲酰氯、正辛基二甲基氯硅烷、吡啶、氯仿、DMF、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯、苯乙酮、無水乙醇(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1CTMB的合成將10 g微晶纖維素分散于300 mL吡啶中，加入34 g 4-甲基苯甲酰氯，于100 ℃下反應24 h，冷卻至室溫后，加入1 L甲醇，析出固體，過濾，干燥得28.5 g CTMB；元素分析：C,69.55%；H,5.46%(理論值：C,69.75%；H,5.46%)；凝膠滲透色譜(GPC)測得重均分子量Mw=113 522，聚合度 ～220。

1.2.2C8修飾硅膠將100 g硅膠(5 μm，1 000 ?，25 m2/g)分散于600 mL甲苯中，加入20 mL 正辛基二甲基氯硅烷和60 mL吡啶，110 ℃回流反應6 h。冷卻至室溫后，加入10 mL三甲基氯硅烷，110 ℃繼續回流反應4 h。過濾，甲醇洗滌，50 ℃真空干燥。元素分析：C，1.38%；H，1.11%。

1.2.3涂覆CTMB將2.0 g CTMB溶解于40 mL氯仿中，加入2.0 g苯甲酸甲酯和8.0 g C8修飾硅膠，拌勻，加入15 g直徑5 mm的玻璃珠，于旋蒸儀上50 ℃緩慢旋干(約3 h)。旋干后的固定相加入30 mL乙醇，超聲分散，過濾(玻璃珠棄除)，加20 mL乙醇洗滌后，將固定相分散于50 mL乙醇中，80 ℃攪拌回流3 h，過濾，50 ℃真空干燥。

1.2.4色譜柱的裝填與評價固定相加甲醇勻漿，于50 MPa壓力下進行裝柱(250 mm×4.6 mm i.d.)，甲醇頂替15 min;系統死時間t0由1,3,5-三叔丁基苯進行測定;分離因子α=(k2-t0)/(k1-t0)。

手性分離條件：流速：1.0 mL/min；溫度：25 ℃；檢測波長：220 nm或254 nm。流動相：化合物1～4，正己烷-異丙醇(90∶10)；化合物5～7，正己烷-異丙醇-三氟乙酸(80∶20∶0.1)。

2 結果與討論

2.1 固定相的制備

氨基硅膠的自身穩定性較差，作為涂覆基質可能會因與對映體的非對映選擇性作用而影響固定相的手性分離能力。有研究采用C18修飾的大孔硅膠作為基質，制備了選擇性與穩定性較好的固定相。但由于C18的位阻作用，多糖衍生物的涂覆受到了一定影響[13]。本實驗選擇C8修飾的硅膠作基質，并用三甲基氯硅烷進行封尾，減小了基質表面性質對分離的影響。

涂覆多糖氨基甲酸酯多采用四氫呋喃和DMF作為溶劑[1]。多糖酯類衍生物則由于在四氫呋喃中溶解性不高，一般選擇氯仿或二氯甲烷作溶劑。由于二氯甲烷沸點較低，蒸發速度不易控制，本實驗主要以氯仿作為CTMB的溶劑，考察了不同添加劑的影響。表1列出了12種固定相(CSP 1～12)制備時對應的涂覆條件與元素分析結果。結果顯示，固定相CSP 1～12的元素分析結果接近，涂覆量相當。除CSP 1外，其余固定相涂覆后幾乎無明顯團聚的顆粒。這是因為涂覆時加入的液態添加劑，可以在旋蒸后期減緩溶劑蒸發速度，同時改善CTMB在硅膠表面的傳質，保證了涂層的均勻性。另外涂覆時加入一些玻璃珠，加強了固定相涂覆時的流動性，也一定程度改善了涂層的均勻性。

表1 固定相CSP 1～12的涂覆條件及元素分析結果Table 1 Coating conditions of CSP 1-12 and their elemental analysis results

* refers to the weight of additive relative to that of CTMB

2.2 選擇性評價

CSP 1～12裝柱(250 mm×4.6 mm i.d.)后，正相條件下對其進行評價。圖1是手性化合物1～7的結構式。表2列出了手性化合物在CSP1～12上的分離數據，主要包括對映體的保留時間和分離因子(α)，以及化合物1在不同CSP上的分離總塔板數。

圖1 手性化合物1～7的結構式Fig.1 Structures of chiral compounds 1～7

CSPPlatenumber*1234567t*1α*t1αt1αt1αt1αt1αt1αCSP 15 3007.831.4617.701.3415.481.217.651.174.582.168.481.217.221.13CSP 28 8007.441.3416.451.2715.201.446.941.364.342.418.301.246.891.14CSP 39 2007.141.5214.241.2913.741.157.131.144.411.908.011.136.891.14CSP 48 0408.151.3719.591.3216.021.357.931.234.712.339.321.287.861.13CSP 57 0007.811.3518.481.2915.531.247.761.234.792.399.441.237.161.11CSP 68 6007.461.3417.051.2815.221.487.161.344.402.568.831.317.011.14CSP 79 1007.951.3619.251.2816.671.467.821.314.762.4810.331.327.941.13CSP 810 0008.461.4121.151.2617.191.328.581.265.122.5010.341.367.501.11CSP 911 5008.921.4523.161.2617.511.179.311.205.622.3111.271.387.871.10CSP107 6008.401.4421.061.2616.421.218.711.215.252.1910.141.357.581.09CSP1110 00010.21.4328.831.2720.861.1610.81.195.972.2611.841.408.621.09CSP127 1007.671.5717.081.2514.731.007.92～14.441.607.641.007.421.08

*plate number:total plate number of the first enantiomer peak of compound 1;t1:retention time of the first eluted enantiomer;α:separation factor of enantiomers

固定相CSP 2、3、4分別涂覆了等量的苯甲酸甲酯、苯酚和硝基苯。與未加任何添加劑的CSP 1相比，前三者均具有較好的裝柱柱效，這主要是由于添加劑在一定程度上改善了固定相涂覆的均勻性。選擇性上，7個手性化合物均在CSP 1～4上得到分離。相對于CSP 2與CSP 4，CSP 1對手性化合物3、4、5的選擇性偏低，CSP 3對于分析物3、4、5、6的選擇性則更低，這可能是由于添加劑苯酚含有氫鍵給體，對CTMB二級結構的影響較苯甲酸甲酯與硝基苯差異較大。

與CSP 2相比，CSP 5將涂覆溶劑由氯仿換成二氯甲烷，其涂覆效果略差，裝柱柱效偏低。選擇性上，分析物1、2、5、6、7變化不大；但分析物3、4略低。

固定相CSP 2、6、7、8、9、10的涂覆體系相同，其中苯甲酸甲酯的添加量依次增加，分別為30%、50%、80%、100%、150%和200%。分離化合物1的總塔板數依次為8 800、8 600、9 100、10 000、11 500、7 600。柱效先呈增高趨勢后又下降，其中以CSP 9的柱效在苯甲酸甲酯添加量為150%時最高。分析物1的保留時間依次為7.44、7.46、7.95、8.46、8.92、8.40 min，分離因子依次為1.34、1.34、1.36、1.41、1.45、1.44，隨苯甲酸甲酯添加量的增加亦呈先增加后下降趨勢，同樣以在CSP 9上最高。推測，隨添加量的增加，苯甲酸甲酯與CTMB酯基部分可發生較強的偶極-偶極作用和π-π作用，從而形成更穩定、有益的二級結構，同時涂層涂覆也更均勻。但添加量過高可能會破壞以上結構[7]。另外，實驗發現相同條件下CSP 2、6、7、8的柱壓比較接近，而CSP 9的柱壓相對高出10%，CSP 10的柱壓則高出20%。可能是添加劑太多導致一些CTMB未涂覆到硅膠表面，在硅球外部產生了聚合物微粒。對于其它分析物，如分析物3、5，CSP 9與CSP 10的選擇性明顯較CSP 8低。綜合考慮柱效、柱壓及選擇性，以CSP 8的性能最佳，即涂覆時添加與涂層等質量的苯甲酸甲酯最適宜。

固定相CSP 11涂覆時的添加劑為與苯甲酸甲酯結構相似的苯乙酮。相對于CSP 8，樣品保留普遍增強；選擇性上，分析物1、2、6、7變化較小，但分析物3、4、5的分離變差。

涂覆添加劑為DMF的CSP 12則表現出柱效偏低，選擇性也較差。分析物3、6無分離跡象；分析物4的分離微弱；分析物5的分離也較其它固定相差。推測由于添加劑無苯環，難以與CTMB形成π-π作用，從而使CTMB的二級結構發生了較大改變。

綜上所述，CSP 8的性能相對優越。圖2為分析物3、4、5在CSP 8上的分離譜圖。

圖2 手性化合物3、4、5在CSP 8上的分離譜圖Fig.2 Chromatograms of chiral compounds 3, 4 and 5 separated by CSP 8

2.3 手性固定相的分離應用

D,L-西孟坦是一種心臟興奮藥，其中L-對映體是主要活性成分。合成L-西孟坦時，往往需要對消旋中間體(8)進行拆分[14-15]。經條件篩選與優化，以純甲醇作流動相時，西孟坦消旋中間體(8)在CSP 8上得到了較好的分離。分析與模擬制備譜圖見圖3。分析柱上，該樣品每針可上樣4 mg。每針周期6 min，1 h可連續進樣10針，共上樣40 mg，鑒于甲醇消耗量不大，且易回收，該分離具有潛在的工業分離應用價值。

R,S-酮咯酸(9)屬于非甾體類鎮痛抗炎藥物，其S-構型比R-構型的鎮痛藥效強230倍。關于S-酮咯酸的不對稱合成法和消旋體拆分法有較多研究[16-17]。經條件篩選與優化，以甲醇-甲酸(100∶0.1)作流動相時，R,S-酮咯酸(9)在CSP 8上得到了較好的分離。分析譜圖與模擬制備譜圖見圖4。分析柱上，該樣品每針可上樣10 mg。每針周期10 min，1 h可連續進樣6針，共上樣60 mg，鑒于甲醇消耗量不大，且易回收，該分離同樣具有潛在的工業分離應用價值。

研究結果顯示，固定相CSP 8對于西孟坦消旋中間體與酮咯酸消旋體的拆分具有分離效率高、溶劑成本低的特點，具有一定工業分離應用潛力。

3 結 論

為研究涂覆型纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相的制備，本文以C8硅烷修飾的大孔硅膠作基質，考察了氯仿或二氯甲烷作溶劑時，分別添加DMF、苯酚、硝基苯、苯甲酸甲酯與苯乙酮對所涂覆固定相的影響。對比發現，添加劑為硝基苯或苯甲酸甲酯時效果較好；DMF作添加劑時選擇性最差。同時固定相的柱效、保留及選擇性與添加劑量也有一定關系。添加劑可能通過氫鍵作用，偶極-偶極作用或π-π作用影響纖維素酯的二級結構，從而影響固定相的選擇性。而涂覆時添加與纖維素酯等質量的苯甲酸甲酯可制得分離能力相對較好的固定相，其對于西孟坦消旋中間體和酮咯酸消旋體展現了良好的手性拆分能力。