慢性乙型肝炎患者血清miR-21水平對肝纖維化程度的評估價值

李文庭 趙宗豪 李宜

肝纖維化是各種慢性肝病包括乙型肝炎發展成為肝硬化和肝癌的必經階段。早期肝纖維化是可逆的[1-2]。因此，早期準確診斷肝纖維化對指導臨床治療具有重要的意義。

肝臟病理是肝纖維化分期的金標準。然而，其有創性以及不可重復性限制了臨床應用。同時，取材以及讀片的誤差使得肝臟病理并不能完全準確地反映肝纖維化程度。基于此，近年來，學者們又開發出了多種無創診斷方法，包括瞬時彈性成像(TE)等[3]，但這些檢測易受多種因素的影響，如患者體型，肝功能(炎癥)，體位等[4]。而前期研究結果顯示，經典血清學檢測指標，如HA、PCⅢ、CⅣ、LN，FIB-4等，其靈敏度和特異度均較低[5]。因此，學者們不斷地尋找新的無創診斷指標。

微小RNA (micro RNA，miR) 是一類高度保守的非編碼RNA分子，長度約為18～22 nt，能調控基因表達，具有廣泛的生物學效能。miR-21被證實在肝纖維化以及肝癌的發病機制中發揮重要作用[6]。然而，關于miR-21在慢性乙型肝炎患者疾病發展過程中是否發揮作用，以及血清miR-21水平能否評估肝纖維化分期，尚無相應研究。本研究納入73例慢性乙型肝炎患者，檢測血清miR-21水平，并分析其與肝纖維化分期的相關性，探索其診斷價值，報道如下。

資料和方法

一、材料

(一) 一般資料 納入2014年7月至2018年4月在我院感染科住院的慢性乙型肝炎患者73例。其中男性48例，女性25例，平均年齡(41.8±12.0)歲。患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[7]。排除標準包括：(1)其他嗜肝病毒感染，如甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎；(2)酒精性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝等；(3)合并原發性肝癌或轉移性肝癌；(4)其他病因導致的肝臟慢性病變，如血吸蟲肝病，肝血管瘤，布加綜合征等。所有患者均簽署知情同意書，且獲安徽省立醫院倫理委員會批準。

(二)材料試劑 RNA 抽提試劑盒購于天根生化科技有限公司(北京)，miRNA逆轉錄試劑盒以及qPCR試劑盒購于金斯瑞生物科技有限公司(南京)。

二、方法

(一)病毒學以及生化指標檢測 所有患者均進行血常規，血生化以及乙型肝炎病毒學檢測，由我院檢驗科完成。

(二) 肝穿刺以及病理學檢查 73例慢性乙型肝炎患者均行肝臟病理檢查。肝穿刺在B超引導下進行，采集的肝組織標本由我院病理科包埋，切片。對組織切片進行HE以及Masson's 染色，并由2位病理醫生獨立閱片進行肝纖維化分期。具體分期標準參照2015年頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》纖維化分期標準[7]。

(三) qPCR檢測患者血清miR-21水平 逆轉錄按照說明書進行，取2 μg RNA，加入逆轉錄酶 1 μL，引物 2 μL， dNTP 0.8 μL,Bufffer 2 μL，加ddH2O配成20 μL體系進行逆轉錄。具體條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min ，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，反應結束后4 ℃保存。

qPCR按照相關說明書進行。逆轉錄成cDNA后，取cDNA 2 μL, 加入qPCR Mix 10 μL，引物各2 μL，ddH2O 4 μL。qPCR在 Applied Biosystems 7 500中完成。具體條件為：95.0 ℃，10 min；95.0 ℃，10 s；60.0 ℃，20 s；72.0℃，10 s，35個循環；使用2-△△Ct法計算miR-21的表達量。miR-21引物為：Forward，5′-ACGTTGTGTAGCTTAT CAGACTG-3′，Reverse 5′-AATGGTTGTTCTCCA CACTCTC-3′。

三、 統計學分析

結 果

一、 73例慢性乙型肝炎患者一般資料

對73例患者一般資料進行了分析：年齡為 (41.8±12.0)歲；ALT 為(41.7±38.5) IU/L；AST為(29.7±17.6) IU/L；按照血清病毒定量分組(lg拷貝數/mL，<3, 3～5, >5)，各組例數分別為 27、16、30。

二、 73例患者血清miR-21的表達

根據病理學檢查，73例患者肝纖維化分期為F0(6例)，F1 (29例), F2(23例), F3(10例), F4(5例)。各組患者血清miR-21表達：F0為0.702±0.105; F1為0.881±0.330; F2為1.234±0.340; F3為1.441±0.255; F4為1.762±0.212。相關分析結果顯示，血清miR-21水平與肝纖維化分期呈顯著正相關(r=0.683，P<0.05)，與乙型肝炎病毒量無顯著正相關關系(r=0.416，P<0.05)。

三、 ROC曲線分析血清miR-21的診斷效能

為明確miR-21對慢性乙型肝炎患者的肝纖維化診斷效能，使用ROC曲線分析。結果表明，分別以血清miR-21值 ≥0.9835，≥1.150和≥1.557為cut-off值診斷F2、F3及F4，其曲線下面積分別為0.860 (95%CI, 0.774～0.946)，0.854(95%CI, 0.768～0.940), 0.929(95%CI, 0.8648～0.995)，見表1。

表1 血清miR-21診斷慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷

(A)隨著肝纖維化程度的增加，血清miR-21表達升高; (B)隨著病毒載量增加，血清miR-21表達升高；*P<0.05

討 論

肝臟受到損傷時，肝細胞以及小葉結構被破壞，肝細胞結節狀再生[8]。同時，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)活化，分泌大量的細胞外基質(extracellular Matrix，ECM)沉積在肝臟，分隔包圍再生肝細胞，形成假小葉。因此，HSC 活化是肝纖維化的核心機制[9]。在慢性乙型肝炎過程中，免疫細胞活化并釋放大量的細胞因子，如轉化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)[10]，加速肝纖維化的形成。

miR-21已被證實在TGF-β1誘導的纖維化進程中發揮重要作用。TGF-β1 體外能誘導miR-21-5p表達，而體外高表達miR-21-5p后，TGF-β1誘導的纖維化進程加速，其機制可能是通過調節miR-21-5p表達。與其他病因不同，乙型肝炎肝纖維化有著獨特的發病機制。目前研究顯示HBx基因能上調肝細胞miR-21表達[10]，這也解釋了單純拮抗TGF-β1并不能有效地抑制乙型肝炎肝纖維化[11]。這也為miR-21成為乙型肝炎肝纖維化的診斷指標提供了理論依據。

本研究結果顯示，隨著肝纖維化分期的升高，患者血清miR-21水平逐漸增加，兩者具有顯著正相關關系。隨著血清病毒載量升高，患者血清miR-21水平逐漸增加，兩者有顯著正相關關系，值得進一步研究。使用ROC曲線進一步探索miR-21的診斷價值，結果顯示以血清miR-21值 ≥0.9835，≥1.150和≥1.557為cut-off值診斷F2、F3及F4，其曲線下面積分別為0.902，0.875, 0.884。與前期結果相比，血清miR-21對肝纖維化的診斷效能明顯高于HA, PCⅢ, CⅣ和LN診斷。因此，可認為血清miR-21具有較好的肝纖維化診斷價值。

肝纖維化分期對慢性乙型肝炎治療方案的制定以及療效隨訪具有重要的臨床意義。相對于肝臟穿刺組織病理學檢查而言，血清學檢查簡單、快速、無創傷，可重復性高，亦可避免肝穿刺的取材誤差。同時，血清miR-21可反映患者體內病毒復制狀態。因此，本研究結果提示可以通過乙型肝炎患者血清miR-21水平評價肝纖維化的分期。

本研究尚存在一些不足，病例數偏少，且缺乏長時間隨訪觀察。因此，今后需要擴大樣本量，延長隨訪時間，從而進一步優化血清miR-21的診斷效能，為該指標的臨床應用提供充分的理論支持。