SUMO特異性蛋白酶3在HBV復制中的作用機制

李青 賴榮陶 盧捷 李自強 謝青 王暉 郭清

慢性乙型肝炎(CHB)感染可能進展為肝硬化和肝衰竭，是導致肝細胞癌(HCC)的主要原因[1]。監測HBV DNA復制是治療相關肝病和降低發病率和死亡率的主要臨床問題。

SUMO化修飾作用廣泛，例如細胞信號傳導，細胞周期，轉錄或致癌[2]。SUMO化修飾是一個動態的過程，被SUMO化修飾的蛋白也可以被SUMO特異性蛋白酶家族(SENP)去SUMO[3]。作為SENP的關鍵成員，SENP3特異性地解偶聯SUMO2或SUMO3，可在細胞應激后迅速增加，例如，氧化應激或高血糖應激[4-5]。上調的SENP3可促進細胞凋亡，增殖和癌癥轉移。然而，SENP3和SENP3相關分子是否參與HBV DNA復制目前尚不清楚。因此，本研究探索SENP3及相關蛋白在HBV DNA復制中的作用。

資料和方法

一、材料

HBV DNA PCR檢測試劑盒(達安)、全自動脫水機(ASP300)、石蠟包埋機(EG1150C)、脫蠟機(Autotainer XL)等均來自于德國Leica公司；實時PCR 試劑(Takara)，7500型 PCR 儀購于(美國)ABI公司；DMEM，FBS，PBS(pH7.2)購自(美國)Gibco公司；SENP3、Akt、p-Akt、β-actin一抗及羊抗兔二抗購自(美國)CST公司；PCDNA3.1、RHSENP3質粒由上海交通大學醫學院易靜課題組贈送；HBV轉基因小鼠購于上海斯萊克動物實驗中心；SENP3的SiRNA及對照購自廣州銳博生物科技有限公司。

二、方法

(一)細胞培養 HepG2、HepG2.215細胞用含有10% FBS和90%的DMEM高糖培養基培養，培養條件：37℃，體積分數為0.05的CO2和適宜濕度的孵箱。

(二)人外周血單個核細胞(PBMC)的分離及總蛋白提取 PBS稀釋患者外周血，Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞， 計數，用含SDS上樣緩沖液裂解PBMC，充分震蕩，100 ℃水浴5 min，冰浴5 min，反復3次，12 000 r/min離心5 min，提取上清液，-80℃保存備用。

(三)質粒轉染 HepG2.2.15細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，RHSENP3質粒組設兩個濃度100 ng和500 ng，對照組為PcDNA3.1空載質粒。待細胞生長融合達70%～80%后，用100 μL opti-DMEM分別稀釋100 ng RHSENP3+400 ng pcDNA3.1、500 ng RHSENP3、500 ng pcDNA3.1質粒和5 μL Lipo 2 000，顛倒混勻，室溫放置15 min，然后逐滴加入HepG2.2.15細胞中，培養48 h。收集細胞提取總蛋白，方法如上，每組實驗重復3次。

(四)SENP3 siRNA轉染 HepG2.2.15細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，設NC組、Si-RNA組。待細胞生長融合達60%～70%后，NC組、si-RNA組按lipo2 000說明書進行轉染，48 h后收集細胞，提取總蛋白，方法如上，每組實驗重復3次。

(五)實時PCR 檢測 使用SYBR○RPremix Ex TaqTM II(Takara，Dalian，China)和ABI 7500儀器(Applied Biosystems，USA)，對SENP3進行擴增。以gapdh為參考基因，應用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達水平。采用達安基因公司的HBV DNA PCR試劑盒檢測待測樣品的HBV DNA載量。

(六)蛋白質印跡 用細胞裂解液裂解PBMC、小鼠肝組織細胞、HepG2、HepG2.2.15細胞，提取細胞總蛋白。BCA法測得蛋白含量。按每個樣本50 μg的蛋白質上樣，SDS-PAGE電泳，經轉膜，4% BSA封閉，一抗、二抗孵育，洗滌后，ECL試劑盒在化學發光成像系統發光檢測。

(七)免疫組織化學染色 小鼠肝組織用40 g/L多聚甲醛，4℃固定過夜，制作石蠟切片，常規切片后，脫蠟；30 mL/L H2O2滅活內源性過氧化物酶，50 g/L BSA 室溫封閉20 min，兔抗SENP3抗體4℃孵育過夜；洗滌后，加二抗，37℃孵育2 h。加顯色劑20 min，核固紅復染，封片后觀察。

三、統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，GraphPad Prism 5. 0軟件進行繪圖。兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 HBV DNA載量與其PBMC中SENP3的含量呈反比

兩例患者HBV DNA經干擾素治療后明顯降低，分別從3×106IU/mL及4.6×104IU/mL降至<500 IU/mL。而外周血中SENP3蛋白含量顯著升高，其含量分別是未經治療時的5.6倍和2.1倍，Akt的磷酸化水平降低，含量分別是未經治療時的23.5%和48.7%，見圖1A。與5名健康人相比，7例CHB患者PBMC中SENP3蛋白含量顯著降低。經灰度定量分析，健康組PBMC中SENP3的蛋白含量是CHB患者的7.4倍，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1B。

圖1 患者PBMC中及HepG2、HepG2.2.15細胞中

二、 HBV轉基因小鼠肝臟中SENP3的表達

與對照組小鼠相比，HBV轉基因小鼠肝臟中SENP3表達顯著降低(圖2)；HBV轉基因小鼠肝組織中磷酸化的Akt含量顯著升高，其灰度值平均是對照組的4.1倍，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖2 HBV轉基因小鼠與對照組小鼠肝組織中SENP3的表達(免疫組織化學染色 低倍放大)

圖3 HBV轉基因小鼠與對照組小鼠肝組織中Akt、p-Akt的表達

三、SENP3和Akt磷酸化水平在HepG2中的表達

SENP3在HBV DNA全基因重組質粒轉染的HepG2受體細胞(HepG2.2.15)中表達量顯著低于未轉染HBV DNA的HepG2細胞，AKT磷酸化水平顯著增高(見圖4A)。

四、 SENP3通過抑制HepG2.2.15細胞中AKT的磷酸化，從而抑制HBV DNA的復制

在RHSENP3質粒轉染100 ng組和500 ng組中，p-AKT的含量分別是對照組(空載質粒)的32.6%和14.8%(P<0.01)，說明SENP3質粒轉染濃度越高，Akt磷酸化水平越低(圖4B)；當給HepG2.2.15細胞轉染100 ng SENP3質粒，細胞中HBV DNA含量由對照組中的7.983.03×106IU/mL降低至3.45×106IU/mL(P<0.01)，若在HepG2.2.15細胞轉染500 ng SENP3質粒，細胞中HBV DNA減少至1.92×106IU/mL(P<0.01)；若使用siRNA干擾HepG2.2.15細胞中SENP3的表達，則Akt磷酸化程度顯著升高，平均是對照組細胞中的5.6倍(P<0.01)(圖4C)。以上結果提示，SENP3是通過抑制肝細胞中Akt的磷酸化水平來抑制HBV DNA復制。

討 論

本研究觀察到CHB患者PBMC中和HBV轉基因小鼠肝臟中的SENP3蛋白含量均顯著降低。在體外實驗模擬HBV感染的細胞模型HepG2.215中，SENP3含量亦顯著降低，SENP3相應的mRNA水平也被證實顯著降低。這些數據表明SENP3在HBV感染發展過程中有明確的作用。已經證實，HepG2.2.15細胞中大量被磷酸化的Akt可因SENP3過表達而減弱，相應的HepG2.2.15細胞中HBV DNA的復制被抑制。說明SENP3能通過抑制Akt磷酸化來抑制HBV DNA的復制。然而，HBV患者肝細胞內SENP3含量與HBV DNA載量之間的相關性缺乏可靠的證據。

圖4 HepG2、HepG2.2.15細胞中SENP3、Akt及p-AKT的表達

已有研究表明，miR-99家族可通過IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR/ULK1信號通路誘導肝細胞自噬，促進HBV復制[6]；此外HBcAg通過激活Akt，ERK和P38信號通路誘導B7-H1上調，從而抑制HBV DNA的清除和減低樹突細胞數量，HBX蛋白可通過與PI3K的催化亞基相結合促進85位點的磷酸化，活化的PI3K也間接的促進了下游AKT的活化[7-8]。以上結果表明，AKT信號通路參與了調控HBV DNA復制的過程，SENP3是調控AKT磷酸化的重要因子。

總之，SENP3在CHB患者和體內動物模型以及體外HBV肝細胞模型中下調。此外，SENP3能通過抑制Akt磷酸化而抑制HBV DNA的復制。這些數據提示SENP3被用作治療HBV的潛在治療靶點的可能性。