非洲豬瘟的樣品采集

文│中國動物疫病預防控制中心

非洲豬瘟（ASF）的任何實驗室檢測都始于樣品采集。樣品采集過程中重要的考慮因素是調查的目的，例如診斷、監測或無疫認證。對哪些動物采樣將取決于抽樣的目的。例如，當調查疫情暴發（被動監測）時，應對針對患病和死亡動物，而在檢查動物是否暴露于病原（主動監測）時，應對年齡最大的動物進行抽樣。

負責抽樣（并進行臨床檢查）的人員在開展相關操作前應該接受過保定豬的技術培訓（包括臨床檢查和取樣）。

采樣小組應根據采樣動物的數量準備充足的采樣設備。

這些實用指南是針對現場和實驗室團隊制定的（譯者：具體操作應首先符合我國相關規定）。

一、采樣所需材料

一般材料：標簽和永久的記號筆；數據記錄表、筆、寫字板；盛放針和刀片的利器盒；高壓滅菌處理袋。

個人保護設備（PPE要求將有所不同，例如監測與暴發調查）：專用服裝（防護服）；橡膠靴；鞋套；手套；面罩；護目鏡；洗手的消毒劑；清洗靴子的消毒劑。

樣品運輸的材料：基本的容器/管/小瓶（防漏并標示清楚）；吸水材料；能夠耐受95KPa的，最好是塑料材質的容器或袋子，作為密封性的2次包裝（即防漏）、用于儲存每只動物樣品的容器和采血管；冷藏箱（4℃），汽車電池驅動為優選，例如，填充有冷卻材料的聚苯乙烯泡沫塑料盒（例如冰、冷凍水瓶或適當的冷包裝，如能使所需溫保持長達數天的具有特殊冷凝膠的一些商品化冰袋）；便攜式-80℃冷凍箱/干冰/液氮罐（僅在距離設備齊全的實驗室進行取樣時才需要）。在運輸樣品時，必須要始終保持上述“三重”安全結構的包裝。

活體動物采樣的材料：保定動物的材料（如套索、木板）；清潔采樣處所需的消毒劑和脫脂棉；采血用的不含抗凝劑的無菌采血管（10毫升）（紅色蓋子）；采集抗凝血的含有EDTA的無菌采血管（10毫升）（紫色蓋子）；根據豬的大小和采樣部位（頸靜脈、耳緣靜脈）選取真空采血管或10～20毫升真空針頭注射器；濾紙/干血斑（DBS）卡。

尸體采樣所需的材料：樣品架或凍存盒；用于收集病料的無菌2毫升凍存管（如果無法滿足冷鏈運輸，可以提前加入RNA保護劑，以便于樣品的保存）；刀、磨刀器、剪切機、帶刀片的手術刀、鉗子和剪刀；盛有消毒劑用于對刀、剪刀進行消毒的容器，從而避免不同臟器和不同動物個體之間的交叉污染；可密封的塑料容器，裝滿10%中性福爾馬林緩沖液（動物臟器體積∶福爾馬林體積比為1∶10）；處置動物尸體所需的適當材料。并包含可能由于其他原因（例如，失效的真空采血管）而丟失或不可用的材料數量。另外，數據收集、個人防護/生物安全和樣品運輸的物品必須包裝。

建議準備一份現場采樣表格，以便將現場收集所有樣品和相關信息統計到一起。如果預期將樣品提交給區域/國際參考實驗室，建議一式兩份取樣，以便對提交的樣品進行留樣，避免在反復凍融或分割樣品。

取樣應小心謹慎，并按照適當的方法避免對動物造成過度的應激或傷害，或對采樣人員造成傷害。應無菌收集并注意避免交叉污染，并始終使用新的針頭以避免疫病傳播。所有等待檢測的樣品都應該被認為有感染性并應進行相應處理。養殖場使用的所有采樣材料應按照當地法規進行安全處理，例如，裝袋并運送回實驗室進行高壓滅菌或適當處置。

提交到診斷實驗室的相關樣品應有清晰且保存持久的標簽，樣品質量良好。

二、樣品類型

1.全血。使用含有抗凝血劑（EDTA-紫色蓋）的無菌管（真空采血管）從頸靜脈、下腔靜脈或耳靜脈抽取全血。如果動物已經死亡，可以從心臟中采血，但必須立即進行。避免使用肝素（綠色蓋子），因為其可以抑制PCR反應（造成假陰性）或由于紅細胞吸附試驗（HAD）造成假陽性的產生。血液是PCR檢測和病毒分離的目標樣品。通過離心分離出的血漿可以用間接免疫過氧化物酶試驗（IPT）或間接熒光抗體（IFA）試驗進行抗體的檢測。

通過干血斑（DBS）進行微量體積血液樣品的采集和儲存，以便進一步進行DNA和（或）抗體檢測。這些卡片在偏遠地區或者在無法冷鏈運輸的時候很有幫助，比如在熱帶地區的狩獵環境和農村地區。然而，使用干血斑（DBS）進行非洲豬瘟檢測時，基因組和（或）抗體檢測測試的靈敏度低于全血或血清樣品。通過將幾滴由刺血針或無菌注射器針頭從動物的靜脈或皮膚滴加到特制的吸水濾紙中完成干血斑（DBS）樣品的收集。血液樣品應該完全浸透在濾紙，并風干數小時。將樣品儲存在低透氣性的塑料袋中，加入干燥劑以減少濕度，即使在熱帶氣候下也可以保持在環境溫度中。

2.血清。使用未加抗凝劑（紅色蓋子）的真空采血管從頸靜脈、下腔靜脈、耳緣靜脈，或剖檢過程收集血液樣品。返回實驗室后，血液樣品應在4±3℃下放置14～18小時以分離血凝塊（譯者：此處與我國實際操作不同，僅供參考）。棄去凝固物，并離心10～15分鐘后，回收澄清的上清液（血清）。如果血清是紅色，這表明樣品發生了溶血，可以在酶聯免疫吸附試驗（ELISA）中產生假陽性反應。通常已經死亡動物的血液樣品易發生溶血（例如野豬）。血清樣品在分離后可以立即開展抗體和病毒檢測，或者在-70℃以下儲存備用。對于抗體檢測，儲存在-20℃已足夠，但是對于病毒檢測，最好存于更低溫度。

3.器官和組織樣品。雖然所有的豬器官和組織都可以用來檢查ASFV的存在（主要是該病的急性和亞急性的形式），但目標器官是脾臟、淋巴結、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟。其中，脾臟和淋巴結是最重要的，因為通常它們的病毒含量是最高的。骨髓也可用于死亡野生動物病例，因為如果動物已經死了一段時間，則骨髓可能是唯一相對保存完好的組織?？梢酝ㄟ^關節內組織液以檢查低毒力毒株的存在。建議將樣品保持在4℃，盡快（48小時內）提交給實驗室。如果由于物流原因無法保障的，樣品可以儲存在冷庫或液氮中。對于組織病理學研究，也可以同時提交用10%緩沖福爾馬林浸泡的樣品。雖然這些樣品不能用于進一步的病毒分離研究，但可用于PCR反應和免疫組織化學試驗。

通過PCR反應、病毒分離和（或）抗原檢測ELISA的方法進行病毒檢測時，需要將樣品用磷酸鹽緩沖液制備成10%（w/v）的均質組織懸液。在離心后，建議對上層清液進行過濾，并用0.1%的抗生素在4±3℃處理1小時。經過勻漿處理組織可以立即用于ASFV病毒和（或）核酸的檢測，或存儲在-70℃以下備用。對于PCR反應，建議對10倍稀釋樣品或上清進行檢測的同時，對未稀釋樣品也進行檢測。從脾臟、肝臟和肺等臟器中提取的滲出物對于使用免疫過氧化物酶試驗（IPT）和間接熒光抗體試驗（IFA）方法檢測抗體非常有用（Gallardo，2015）。

4.軟蜱樣品。鈍緣蜱屬軟蜱可以用于檢測ASFV和病毒基因組?？蓮酿嘭i的洞穴、裂縫、洞穴中收集蜱蟲，有時也可以從豬圈內的嚙齒類動物的洞穴中收集。不同種類的蜱會有不同偏好的場所和棲息地。有三種收集技術：手動收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應讓蜱保持存活或直接儲存在液氮中，以確保蜱內病毒的保存完好，并避免DNA降解。

目標樣品的最小需求量。對于使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的抗體檢測以及驗證性試驗，建議的最小劑量為：血清500微升。對于使用PCR反應和病毒分離的方法檢測非洲豬瘟（ASF）病毒時：血清1毫升；血液（EDTA-血液）1毫升；沒有福爾馬林的器官（推薦的最低量）5克。（注：本文節選自《聯合國糧食及農業組織（FAO）動物生產及衛生手冊》）