達瑪烷苷元抑制IKKβ— NF—κB信號通路預防煙草誘發肺癌有效性的研究

吳瑾　劉丹　楊玉光　周紅鳳　胡曉薇　劉文濤

摘 要：研究達瑪烷苷元通過抑制IKKβ- NF-κB信號通路預防煙草誘發的肺癌。方法 選取昆明種小鼠分為對照組和達瑪烷苷元不同劑量干預組建立模型，監測達瑪烷苷元對小鼠血清中炎癥因子水平、對IKKβ- NF-κB信號通路、對IKKβ- NF-κB信號通路下游抗凋亡相關蛋白、對腫瘤侵襲轉移相關分子的影響。結果 干預組計數肺表面的腫瘤結節數和形態、顏色、大小等，可見腫瘤控制情況良好。TNF-α等炎性因子、抗凋亡蛋白、IKB激酶、ICAM-1的測定，干預組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統計學意義。結論達瑪烷苷元通過抑制IKKβ- NF-κB信號通路預防煙草誘發的肺癌的發生效果明顯，值得臨床廣泛推廣應用。

關鍵詞：達瑪烷苷元；IKKβ-；NF-κB信號通路；肺癌

惡性腫瘤是人類健康的殺手，業已成為常見病、多發病，達瑪烷苷元在治療腫瘤的臨床應用上取得了一定成績[1]，得到了國際腫瘤醫學界的廣泛認可。本文從其上游炎癥因子和下游蛋白表達的角度研究了達瑪烷苷元通過如何抗炎途徑來預防肺癌發生和發展的分子機制，現報道如下：

1材料與方法

1.1試劑與材料

達瑪烷苷元（徐州市達瑪烷苷元注射劑；2017021001）氯化鈉注射液（哈藥集團三精制藥股份有限公司；2017101021）ELISA試劑盒（AIPUINS；33363319146）；昆明種小鼠（20-25g）。

1.2方法

1.2.1模型建立。選取昆明種小鼠分為幾組（對照組和達瑪烷苷元不同劑量干預組），分別暴露于煙草煙霧的動式染毒柜中，每天6個小時，每周5天，連續暴露5個月，恢復4個月之后處死，進行形態學和病理學診斷及氧化指標檢測，比較各組間差異。

1.2.2達瑪烷苷元對小鼠血清中炎癥因子水平的影響。采用ELISA方法對不同組別中小鼠血清中TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平進行測定。

1.2.3達瑪烷苷元對IKKβ- NF-κB信號通路的影響。用原位雜交法和免疫組化檢測肺組織IKB激酶mRNA（IKKβ mRNA）及核轉錄因子（NF—κB）P65亞基活性。

1.2.4達瑪烷苷元對IKKβ- NF-κB信號通路下游抗凋亡相關蛋白的影響。采用Western-blot方法檢測達瑪烷苷元對抗凋亡蛋白Survivin（生存素）、CLAPS-1、2、XIAPS、Bcl-2、Bcl-XL的影響并且采用RT-PCR對其mRNA進行測定。

1.2.5達瑪烷苷元對腫瘤侵襲轉移相關分子的影響。采用ELISA方法檢測細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和內皮白細胞粘附分子（ELAM-1）、基質金屬蛋白酶MMP-9及MMP-2、尿激酶型纖溶酶激活物（uPA） 。

1.3數據統計

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據處理分析，定量資料以（ ）表示，組間比較采用t檢驗，定性資料的組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1模型驗證

2.2.1 肺癌模型。在動式染毒柜中采取動式吸入染毒，控制11%和89%的主側流煙霧，控制總懸浮微粒（TSP）[2]濃度為119 mg·m-3，并監測CO、CO2 及O2 含量。以TSP 和CO含量為吸煙暴露指標。染毒5 d∕周，6 h∕d，連續5個月，恢復4個月。將清潔級昆明系小鼠250只，隨機分為5個組。正常對照組，動物不加任何干預；干預組高、中、低劑量達瑪烷苷元，染毒方式同上，給藥9個月。

2.2.2 病理學診斷。染毒實驗結束后，將小鼠用過量的戊巴比妥殺死，手術切除全肺，0.9 %生理鹽水清洗，隨即抽取部分小鼠的全肺組織，并用Tellyesniczky 固定液肺臟灌注，之后置于Tellyesniczky 固定液中至少24 h，移至70%酒精中。解剖并計數肺表面的腫瘤結節數和形態、顏色、大小等，編號、拍照。

2.2ELISA方法測定TNF-α等炎性因子：

雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ELISA）法，分別測定各組小鼠血清中TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平。干預組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統計學意義。

2.3 IKB激酶mRNA（IKKβ mRNA）及NF—κB P65亞基活性的測定：右下肺固定部位組織塊IKKβ、mRNA 的檢測，干預組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統計學意義。

2.4Survivin等抗凋亡蛋白的測定：

Westernblot檢測Survivin及XIAP的表達，經圖像分析系統分析，干預組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統計學意義。以與β-actin的灰度比值表示Survivin和XIAP表達的相對強度比較，干預組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統計學意義。

2.5ICAM-1等腫瘤侵襲轉移相關分子水平的測定

采用ELISA方法檢測小鼠血清中細胞間粘附分子-1（ICAM-1）和內皮白細胞粘附分子（ELAM-1）、基質金屬蛋白酶MMP-9及MMP-2、尿激酶型纖溶酶激活物（uPA），測定結果干預組較對照組明顯，且P<0.05，差異有統計學意義。

3.討論

吸煙可能提高肺癌的易感性已經成為大家都接受的共識，究竟吸煙如何影響肺癌的發生人們卻不得而知，本文研究了煙草導致小鼠肺癌發生和發展機制，以IKKβ- NF-κB信號通路作為主要研究靶點，研究結果將為肺癌的預防（尤其是吸煙導致的肺癌）和治療提供新的思路。

參考文獻：

[1]熊非，劉健，李燦，等.應用納米技術發展血液惡性腫瘤檢測與治療的新技術和新方法[J].中國基礎科學，2016，18（3）：11-12.

[2]張菊. TSP-1及其受體CD47在百草枯中毒大鼠肺纖維化模型中的作用及機制初步探討[D].川北醫學院，2016.

項目名稱：達瑪烷苷元通過抑制IKKβ- NF-κB信號通路預防煙草誘發的肺癌的研究。

項目編號：ZHY10-288，資助單位：黑龍江省中醫藥管理局。

責任作者：吳瑾女 1963年12月生人教授哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院。