轉 TaSCL14基因小麥的遺傳穩定性及農藝性狀分析

牛艷路，朱 浩，王 佩，陳坤梅，李宏偉，陳耀鋒

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100； 2.中國科學院遺傳與發育生物學研究所，北京 100101； 3.中國農業科學院麻類研究所，湖南長沙 410205)

作物的產量主要來自光合作用的物質積累，但植物的光能利用率僅為1%～2%[1]，因此選育高光效品種來提高作物的光能利用率是提升作物產量的有效途徑。但傳統的育種方法育種年限長且利用的基因有限，而轉基因技術的發展大大縮短了育種周期，為小麥基因資源的利用、種質創新和品種改良開辟了新的途徑和方法。1992年，世界第一株轉基因小麥誕生[2]，此后小麥轉基因技術不斷發展優化，目前作物轉基因技術已涉及抗病蟲[3]、抗逆[4]、品質改良[5]和產量提高[6-7]等多方面。因此，可以利用轉基因技術將高光效基因轉入小麥品種，結合傳統育種方式，選育高光效種質。有研究發現，將高光效丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)基因轉入秈稻，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因轉入水稻、小麥和大豆等作物均能夠引起轉基因植株的產量或光合特性的提高[8-11]。

GRAS蛋白是存在于多種高等植物中的重要的轉錄因子，GRAS的名字來源于最初被發現的三個功能成員GIBBERELLICACIDINSENSITIVE(GAI)、REPRESSOROFGAI(RGA)和SCARECROW(SCR)[12]。它有8個亞家族：DELLA、LISCL、HAM、PATI、SCR、LS、SCL3和SHR，在植物分生組織形成、光、赤霉素信號傳導、生長發育、生物及非生物脅迫過程中起著重要的作用[13-14]。目前，已在水稻[15]、葡萄[16]、胡楊[17]、佛手[18]、枳[19]和煙草[20]等多種植物中發現GRAS家族基因。1996年，SCR基因在擬南芥中被克隆，該基因在擬南芥側根形成上起關鍵作用[21]。2010年，Ma等[17]克隆了胡楊中的一個GRAS基因PeSCL7，轉PeSCL7基因的擬南芥對干旱和鹽的耐受性顯著增強。2015年，陳坤梅等[22]從小麥品種小偃54中篩選并克隆了強光效應基因TaSCL14，并證實TaSCL14基因是小麥GRAS轉錄因子家族的一員；利用大麥條紋花葉病毒介導的基因沉默技術將TaSCL14基因沉默，發現小麥植株的生物量下降，凈光合速率降低，并通過基因槍介導法將TaSCL14基因導入普通小麥品種小偃39中，獲得了一批轉TaSCL14基因的小麥植株。為了獲得農藝性狀優良的轉TaSCL14基因小麥品系，本研究在此基礎上，采用普通PCR和qRT-PCR技術分析轉TaSCL14基因小麥后代中外源基因的遺傳穩定性，并對主要的農藝性狀特性進行分析，以期為該基因在高光效品種改良中的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為普通小麥小偃39以及以小偃39為受體通過基因槍轉化法獲得的轉TaSCL14基因的T1～T3代植株。轉基因后代分別于2015-2016和2016-2017年度種植于陜西省楊凌示范區西北農林科技大學轉基因材料試驗田，四周設置保護行，按田間常規管理。

1.2 PCR檢測

在轉基因小麥拔節期進行取樣，CTAB法提取基因組DNA，根據TaSCL14基因全長及載體序列設計正反向引物進行基因組DNA分子檢測。正向引物F:5′-GCCGTGGATGACAGTG AGA-3′，反向引物 R：5′-TAATACGACTCACT ATAGGG-3′。PCR擴增體系與程序參考TaqDNA聚合酶(TaKaRa，日本)說明書，其中循環數為35，退火溫度為55 ℃，延伸時間為2 min，擴增產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 RNA的提取和qRT-PCR

植物總RNA提取參照植物總RNA小量提取試劑盒(美基生物，廣州)說明書進行。RNA提取后用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，反轉錄采用PrimerScriptTMII 1st strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa，日本)。以反轉錄得到的 cDNA為模板，目的基因的引物序列為F：5′-CGAGGAGACGGGGCACAGG-3′，R：5′-CGTC CATCAGGTGCCTGAAGTGAC-3′；小麥Actin基因作為內參，內參引物序列為F：5′-TGTTGT TCTCAGTGGAGGTTCT-3′，R：5′- CTGTAT TTCCTTTCAGGTGGTG-3′，在ABI PRISM 7700熒光定量PCR儀(ABI，美國)上進行qRT-PCR。反應體系與程序參考2×SuperReal Color PreMix(天根生化，北京)說明書，其中循環數為40，退火溫度為60 ℃，退火時間為45 s。反應結束后，通過熔解曲線分析確認擴增的特異性。每個樣品3次技術重復，試驗共設3次生物學重復，根據2-ΔΔCT法計算TaSCL14基因的相對表達量。

1.4 轉基因植株農藝性狀調查

2015年10月種植轉TaSCL14基因T1、T2代株行，以受體小麥小偃39為對照，T2代經由前一年篩選T1代陽性單株得到，行長1 m，行距0.2 m，株距20 cm。在小麥進入越冬期停止分蘗后調查的分蘗作為冬前分蘗，在年后小麥起身前調查的分蘗作為冬后分蘗，分蘗芽從基部葉腋內伸出2 cm作為分蘗的計數標準。植株成熟后調查全部植株的株高、有效分蘗、穗長、小穗數、穗粒數和千粒重。選擇T2代農藝性狀表現優良且篩選為陽性植株的4個株系于2016年10月按株系種植作為T3代，每個株系種植5行，行長1.5 m，行距0.2 m，株距5 cm，隨機區組排列，3次重復，每次重復包含2個受體對照。幼苗期每個小區隨機調查15株小麥的冬前和冬后分蘗情況，成熟后從每個小區抽取10株，測量T3代小麥各個株系的農藝性狀以及每平方米穗數用于測產。

1.5 數據處理

數據處理及分析使用軟件Excel 2010和SPSS 22.0進行。

2 結果與分析

2.1 轉 TaSCL14基因T1、T2代植株的PCR檢測及農藝性狀分析

2.1.1 轉TaSCL14基因T1、T2代植株的PCR檢測結果

T0代得到56個單株，經篩選，T0代單株所結種子種植為株行，T1代種植40個株行，共170株；T2代種植62個株行，共236株。轉基因小麥T1代和T2代植株PCR檢測結果表明，所有陽性植株均擴增到約1 700 bp的特異片段，而陰性植株和對照(小偃39)中無特異條帶(圖1)。通過統計共檢測出陽性植株297株，其中T1代95株，T2代202株，陽性率分別為55.9% 和85.6%。

2.1.2 轉TaSCL14基因小麥T1、T2代主要農藝特性

調查結果(表1)表明，對照小偃39及轉基因T1、T2代在冬后分蘗數、有效分蘗數、株高、穗長、小穗數和千粒重等主要農藝性狀上均無顯著差異，但T1代轉基因植株的穗粒數顯著低于對照；T2代轉基因植株的冬前分蘗數顯著高于對照。T1、T2代的千粒重略低于對照，T2代的農藝性狀整體優于T1代。

M：DL2000 ；1：對照(小偃39)；2～9：陽性植株；10：陰性植株。

M:DL2000; 1:CK(Xiaoyan39); 2-9:positive plants; 10:negative plant.

圖1 轉基因植株中 TaSCL14基因的PCR擴增結果

*表示在0.05水平上與對照差異顯著。下同。

* indicates significant difference with CK at 0.05 level.The same in the following tables.

把T1、T2代各陽性單株的農藝性狀與對照小偃39進行比較，分析各性狀高于和低于對照的植株數量占各世代植株總數的比例以及各性狀均值與對照的差異程度，結果(表2)表明，T1、T2代陽性植株的冬后分蘗數平均比對照多4.26個和5.03個，高出了對照33.89%和40.10%，差異較大，表明該基因的轉入對冬后分蘗的影響較大。此外，T1代中千粒重高于對照的植株數僅占26.19%，而千粒重低于對照的植株數占73.81%，在T2代這兩個值分別為21.05%和78.95%，這表明TaSCL14基因的轉入對轉基因小麥T1、T2代千粒重主要產生負效應。同時，發現從T1代到T2代各農藝性狀高于對照的植株占比在上升。

表2 T1、T2代植株農藝性狀與對照的比較Table 2 Comparison of agronomic characters between T1 and T2 plants and controls

2.2 轉 TaSCL14基因T3代植株分子檢測及農藝性狀分析

2.2.1 轉TaSCL14基因T3代植株分子檢測結果

對4個來源不同的轉TaSCL14基因T3代株系3-4、3-7、3-8和3-11及對照小偃39，在拔節期每個株系和對照隨機選取10株提取基因組DNA，進行PCR檢測，結果(圖2)顯示，對照株系小偃39中不能擴增出目的條帶，而轉基因株系全部可以擴增到約1 700 bp的特異片段，說明4個轉基因株系陽性率能達到90%以上，表明這4個轉基因株系已基本純合。

M:DL2000；1～4:株系3-4、3-7、3-8、3-11；5:對照(小偃39)。

M:DL2000; 1-4:Line 3-4, 3-7, 3-8, 3-11; 5:CK(Xiaoyan 39).

圖2轉基因T3代株系的PCR檢測結果

Fig.2PCRampliconfromtransgenicT3strains

為了研究TaSCL14基因在轉基因后代的表達情況，對不同的轉基因T3代株系和對照材料在幼苗期取樣進行qRT-PCR。結果(表3)表明，4個轉基因株系3-4、3-7、3-8和3-11的表達水平均高于對照，且與對照呈極顯著差異。

2.2.2 轉TaSCL14基因T3代小麥農藝性狀分析

4個轉基因株系在T3代整個生育時期各項農藝性狀的觀測結果(表4)表明，轉基因各株系的冬前分蘗數、冬后分蘗數和有效分蘗數都高于對照，其中轉基因株系3-7的冬前分蘗數與對照存在極顯著差異，株系3-11與對照存在顯著差異；轉基因株系3-7的冬后分蘗數與對照存在極顯著差異，株系3-4與對照存在顯著差異。4個轉基因株系有效分蘗數的變化范圍為7.3～8.5，平均比對照高2.68個；差異顯著性分析表明，轉基因株系3-4與對照存在顯著差異，株系3-7和3-11均與對照存在極顯著差異，表明目的基因的導入對T3代3-4、3-7和3-11株系分蘗的影響較為明顯。各株系小穗數均比對照上升，株系3-4的小穗數與對照存在顯著差異。但各轉基因株系的株高和穗長均與對照不存在顯著差異。

表3 轉基因株系及其對照 TaSCL14基因的相對表達量Table 3 Relative expression of TaSCL14 gene in transgenic lines and their control

**表示與對照差異極顯著(P<0.01)。下同。

** indicates significant difference with CK at 0.01 level.The same in the following tables.

T3代中4個轉基因株系的每平方米穗數和穗粒數都高于對照，穗粒數平均高3.39粒，但差異不顯著。轉基因株系的千粒重均不同程度的比對照下降，平均下降了2.73 g，株系3-7極顯著低于對照。但轉基因株系3-4、3-8和3-11的理論產量高于對照，這與它們每平方米穗數和穗粒數的增加有關(表5)。

表4 T3代轉基因株系的農藝性狀Table 4 Agronomic traits of transgenic wheat lines in T3 plants

表5 T3代轉基因株系的產量性狀Table 5 Yield traits of transgenic wheat in lines of T3 plants

3 討 論

近年來植物轉基因技術研究發展迅速，抗除草劑大豆和油菜、抗蟲玉米和棉花等轉基因品種已有商業化種植[23]，取得了巨大的經濟和社會效益。小麥是異源六倍體植物，基因組相對較大，遺傳背景復雜，這造成了它的轉化難度較大。外源基因能否在轉基因小麥中穩定的遺傳表達是轉基因小麥具有研究價值的關鍵。本研究發現外源基因TaSCL14在轉基因小麥T1～T3代中都能夠被檢測到，這證實了轉基因植株的真實性。目的基因TaSCL14在連續多代中都能被檢測到，這同王軍衛[24]等研究轉基因后代的遺傳表現相一致，表明目的基因能在后代中穩定遺傳。成功轉入外源基因的轉基因后代的農藝性狀除受品種本身的遺傳特性影響外，還與種植條件和種植環境有關。李陳建等[25]研究T4代轉sGNA基因小麥株系在大田條件下的生長情況發現轉基因株系的生長特性未發生改變，個體正常生長發育，但千粒重和小穗數達到了顯著水平。閆海生等[26]進行轉OsCYP2基因水稻的研究，發現轉基因植株的分蘗數明顯增加，但是穗粒數、千粒重等多個性狀表現低于對照。實驗室在前期研究中發現，TaSCL14基因沉默會致使小麥沉默株系植株變得矮小、分蘗數和葉片數減少，生物量下降，光合性能降低。而TaSCL14基因在擬南芥中的過表達能提高轉基因植株的產量和光合特性[22]。

本試驗發現，在田間栽培條件相同的情況下，轉TaSCL14基因小麥植株能夠正常生長發育，植株的形態特征與對照相比變化不大，但在轉基因小麥后代的分蘗、小穗數、穗粒數和千粒重等方面均發生了一些變化。轉基因植株T1代的穗粒數、T2代的冬前分蘗數都與對照存在顯著差異，T1、T2代均有75%左右的轉TaSCL14基因植株千粒重低于對照，可見TaSCL14基因的轉入對大多數植株的千粒重呈現負效應。TaSCL14基因在T3代的四個轉基因株系中都過表達，4個轉基因株系的株高、穗長、穗粒數與對照無差異，大多數株系的各時期分蘗數都顯著或極顯著高于對照，千粒重都低于對照，可見轉入基因過表達對于分蘗和千粒重的影響較大。這與T1和T2代的田間農藝性狀表現也基本一致。秦保平等[27]對于轉Hpa110-42基因小麥株系的研究發現，轉基因各株系小穗數和千粒重顯著上升；王瑞霞等[28]對轉反義PLDγ基因小麥的研究發現，轉基因株系的株高、千粒重、單株穗數與受體相比顯著增加，這和本研究結果(T1～T3代株高與對照無差異，千粒重下降)有所不同，可能是因為轉基因使用的受體材料、外源基因的種類、基因整合位點、整合的拷貝數等存在差異[29-30]。同時，本研究也發現，轉基因T2代植株總體的農藝性狀要優于T1代植株，T3代各株系的農藝性狀要整體優于對照，這可能是由于在轉基因高代目的基因的分離已基本趨于穩定，因此轉基因植株的性狀也較為穩定。

本研究表明，外源TaSCL14基因的導入能夠影響小麥轉基因后代的部分農藝性狀，隨著篩選世代的增加，基因的遺傳表達趨于穩定且株系間的表達量存在差異。由于TaSCL14基因屬于轉錄因子基因且是一個強光響應基因，所以調查轉基因小麥田間農藝表現和篩選出穩定轉基因株系對后期進一步探究該基因對于小麥光合特性影響具有重要意義。