上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料應(yīng)用進(jìn)展及其檢測(cè)系統(tǒng)的研究

陳婷婷，杜民，陳建國(guó)，甘振華，柯棟忠，黃美蘭

1. 福州大學(xué) a. 物理與信息工程學(xué)院；b. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c. 電氣工程與自動(dòng)化學(xué)院；d. 生物科學(xué)與工程學(xué)院；福建 福州 350108；2. 福建工程學(xué)院 福建省汽車電子與電驅(qū)動(dòng)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350118

引言

上轉(zhuǎn)換發(fā)光（Upconversion Luminescence，UCL）是一種稀土離子吸收2個(gè)或2個(gè)以上的低能光子而輻射高能光子的發(fā)光現(xiàn)象，屬于反斯托克斯發(fā)光[1]。在20世紀(jì)50年代末，這種在紅外光激發(fā)下能發(fā)出可見光的上轉(zhuǎn)換納米材料被首次發(fā)現(xiàn)[2]，直到在20世紀(jì)90年代后期，隨著納米科技的興起，人們開始將其作為一種紅外光轉(zhuǎn)可見光的材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測(cè)和食品安全等多個(gè)領(lǐng)域[3-4]。

1 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料發(fā)光機(jī)理和特點(diǎn)

1.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)理

2004年，Auzel[2]將上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制歸結(jié)為以下4種：激發(fā)態(tài)吸收上轉(zhuǎn)換、能量傳遞上轉(zhuǎn)換、直接雙光子吸收上轉(zhuǎn)換和光子雪崩上轉(zhuǎn)換。激發(fā)態(tài)吸收（Excited State Absorption，ESA）在1959年被提出，屬于單個(gè)離子的吸收，指的是處于基態(tài)的離子通過吸收多個(gè)低能量的光子達(dá)到激發(fā)態(tài)，之后由激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)，輻射出比激發(fā)光波更短、能量更高的光子。

根據(jù)傳遞方式的不同將能量傳遞（Energy Transfer，ET）分為連續(xù)能量轉(zhuǎn)移、協(xié)同上轉(zhuǎn)換、交叉馳豫。能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程是離子之間的相互作用，與激發(fā)態(tài)吸收上轉(zhuǎn)換不同的是要依賴于離子濃度，為了保證能量傳遞的發(fā)生離子濃度必須足夠的高。

直接雙光子吸收指的是離子吸收光子，沒有中間亞穩(wěn)態(tài)直接從基態(tài)躍遷到終態(tài)，輻射出能量高的光子。

1979年，Chivian等[5]在研究LaCl3晶體中上轉(zhuǎn)換發(fā)光時(shí)首次提出光子雪崩上轉(zhuǎn)換，指的是在能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程，處于中間的亞穩(wěn)態(tài)像雪崩一樣急劇增加，當(dāng)離子濃度達(dá)到足夠高時(shí)，躍遷回基態(tài)時(shí)會(huì)輻射短波長(zhǎng)的光子的過程。

1.2 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的發(fā)光特點(diǎn)

相對(duì)于傳統(tǒng)以有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)作為下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為新一代生物熒光標(biāo)記具有的顯著優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

（1）化學(xué)穩(wěn)定性高，不易被光漂白，易于長(zhǎng)時(shí)間的觀察。有機(jī)染料常用的如異硫氰酸熒光素FITC及花菁染料Cy3和Cy5[6]，其光學(xué)穩(wěn)定性較差，易發(fā)生光漂白。由于稀土上轉(zhuǎn)換材料采用稀土氟化物、硫化物、氧化物等這些材料的穩(wěn)定性好，易于長(zhǎng)時(shí)間的觀察[7]。

（2）水溶性好、毒性低。隨著上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的不斷引入與研究，2010年復(fù)旦大學(xué)Xiong等[8]通過實(shí)驗(yàn)研究表明可以將其安全地用于生物活體成像研究中。隨著水溶性稀土化合物的合成解決了早期上轉(zhuǎn)換熒光納米材料存在的水溶性差、顆粒尺寸較大等相關(guān)問題[9]。

（3）采用近紅外作為其激發(fā)源，解決了穿透深度低、傷害生物組織的問題[10]。采用近紅外（650～1100 nm）作為激發(fā)源，與傳統(tǒng)的可見光區(qū)域的熒光成像對(duì)比，組織的穿透深度提高了5～10 mm[11]。同時(shí)采用近紅外作為激發(fā)源屬于長(zhǎng)波激發(fā)解決了紫外激發(fā)對(duì)生物組織長(zhǎng)時(shí)間照射引起對(duì)生物組織傷害的問題[12]。

（4）發(fā)射光譜特性突出，熒光量子產(chǎn)生率高（3.1%），反斯托克位移較大，一般在200 nm以上[13]。較大的反斯托克位移使激發(fā)光不會(huì)干擾探測(cè)信號(hào)的接收，提高了檢測(cè)靈敏度，同時(shí)窄帶濾波片的易配能夠節(jié)約成本。

（5）熒光壽命較長(zhǎng)（約1 ms），是生物背景熒光壽命的105～106倍[14]。在進(jìn)行時(shí)間分辨熒光顯微成像測(cè)定和熒光壽命成像時(shí)，可以利用這種長(zhǎng)壽命的熒光避免背景熒光的干擾。

（6）檢測(cè)靈敏度高、具有超高選擇性、解決了自發(fā)熒光干擾的問題。作為熒光標(biāo)記應(yīng)用于生物標(biāo)本只能觀察上轉(zhuǎn)換熒光材料本身發(fā)光，而不具備上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能的被測(cè)生物分子不發(fā)熒光，由此消除來自內(nèi)源性熒光物質(zhì)和同時(shí)標(biāo)記熒光染料的背景干擾，檢測(cè)背景值降低，檢測(cè)靈敏度提高。

2 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來越多研究人員關(guān)注稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，下面介紹目前國(guó)內(nèi)外研究者在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.1 生物成像

由于稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米材料優(yōu)越的化學(xué)性質(zhì)以及低毒性使其在生命醫(yī)學(xué)等方面得到廣泛運(yùn)用。1999年，Zijlmans等[15]首次利用氙燈提供近紅外激發(fā)由大顆粒（200～400 nm）上轉(zhuǎn)換熒光組成的抗體，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合將前列腺組織切片進(jìn)行標(biāo)記，通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)采用上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記的組織比采用有機(jī)染料標(biāo)記的組織更易識(shí)別其分布。2006年，Lim等[16]首次將50～150 nm的Y2O3：Yb3+/Er3+稀土上轉(zhuǎn)換熒光材料用于標(biāo)記線蟲，但由于該熒光材料尺寸較大，導(dǎo)致其依舊不適用于動(dòng)物活體成像。2008年，Chatterjee等[17]首次將上轉(zhuǎn)換納米粒子應(yīng)用于動(dòng)物更深層的組織進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)合成的PEI-NaYF4：Yb3+/Er3+納米粒子穩(wěn)定性較好，生物毒性低同時(shí)與量子點(diǎn)比較其熒光強(qiáng)度和組織穿透能力都強(qiáng)于量子點(diǎn)。Jalil等[18]研究發(fā)現(xiàn)二氧化硅包覆的NaYF4上轉(zhuǎn)換納米晶體表現(xiàn)出良好的體外和體內(nèi)生物相容性，展示了其在細(xì)胞和動(dòng)物成像系統(tǒng)中的潛在應(yīng)用。2009年，復(fù)旦大學(xué)的化學(xué)與高級(jí)材料研究所的Yu等[19]提出一種獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像方式，引入反向激發(fā)二向色鏡和共焦針孔技術(shù)-激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像，該技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)可以消除來自內(nèi)源熒光基團(tuán)以及外源性熒光的干擾，靈敏度高、選擇性強(qiáng)、與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡的兼容性好。2009年，Xiong等[20]實(shí)現(xiàn)了小鼠全身光發(fā)光成像的小于50個(gè)納米標(biāo)記細(xì)胞的檢測(cè)極限。近年來，結(jié)合傳統(tǒng)的核磁共振成像、電腦斷層掃描、熒光分子成像等多種技術(shù)獲取具有分辨率高、成像快速、分子水平的多模式生物成像技術(shù)。如2017年，Chen等[21]研制了一種以上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為基礎(chǔ)的膠束結(jié)合化療、光動(dòng)力治療、熒光成像，通過實(shí)驗(yàn)研究表明在體外和體內(nèi)都具有良好的成像能力。

2.2 生物檢測(cè)

上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在生物檢測(cè)目前主要應(yīng)用在蛋白質(zhì)檢測(cè)、離子檢測(cè)、陰陽離子識(shí)別、檢測(cè)小分子、核酸檢測(cè)、檢測(cè)溫度、免疫分析。其檢測(cè)原理是根據(jù)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料可以通過調(diào)節(jié)元素?fù)诫s的濃度以及種類來調(diào)節(jié)輻射光，在具體實(shí)驗(yàn)中可以先制備所需的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為供體，然后選擇能量受體通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。2005年，Wang等[22]最早基于FRET過程來檢測(cè)親和素濃度，在實(shí)驗(yàn)中將生物素連接的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為供體，Au納米粒子作為受體；Kuningas等[23]研究的一種基于FRET過程的檢測(cè)17β-雌二醇，將上轉(zhuǎn)換熒光材料作為供體，小分子染料作為受體；Liu等[24]研究一種利用FRET過程設(shè)計(jì)的檢測(cè)谷胱甘肽（GSH）分子的方法；Wu等[25]結(jié)合磁性納米顆粒和雙光子分別與捕獲的DNA和報(bào)告的DNA結(jié)合，檢測(cè)腸道病毒71和柯薩奇病毒A16；隨后在2013年，Liu等[26]又研究的一種將花青染料hCy7和UCNPs的熒光探針用于甲基汞的檢測(cè)；Hemmer等[27]研究的一種用UCNPs和有機(jī)染料來檢測(cè)亞細(xì)胞水平的溫度的納米溫度計(jì)；Ju等[28]研究將單鏈DNA和LiYF4結(jié)合，制備DNA探針，用于定量檢測(cè)目標(biāo)DNA；Wu等[29]研究的一種基于上轉(zhuǎn)換熒光材料與石墨烯結(jié)合的FRET的基礎(chǔ)上的生物傳感器用于檢測(cè)艾滋病抗體；Rijke等[30]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記檢測(cè)核酸的靈敏度是有機(jī)染料Cy5標(biāo)記的4倍。雖然目前稀土上轉(zhuǎn)換納米材料用于生物檢測(cè)的取得一些成果但與傳統(tǒng)的有機(jī)染料以及量子點(diǎn)而言依舊是處于研究的初步階段。

2.3 光動(dòng)力治療

光動(dòng)力效應(yīng)是光動(dòng)力治療的作用基礎(chǔ)，是一種有氧分子參與的伴隨生物效應(yīng)的光敏化反應(yīng)，其基本要素是氧、光敏劑和可見光。近幾年，上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在光動(dòng)力治療方面被廣泛運(yùn)用[31]。早期，Zeng等[32]研究的利用上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面依附光敏劑AIPcS4從而達(dá)到光動(dòng)力學(xué)治療的目的；Wang等[33]研究一個(gè)應(yīng)用于小鼠活體實(shí)驗(yàn)的上轉(zhuǎn)換納米材料基的光動(dòng)力學(xué)治療體系；Qiao等[34]將三官能核殼結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子與光敏劑共價(jià)接用于熒光成像、磁共振成像和光動(dòng)力學(xué)治療。最近，Liu等[35]研究的基于上轉(zhuǎn)換納米粒子的熱膠束雙模成像和光動(dòng)力治療肝癌，該研究中使用一種抗腫瘤藥物和光敏劑mitoxantrone（MX）將其與抗EpCAM抗體接枝的上轉(zhuǎn)換納米膠束，用于雙模式磁共振/上轉(zhuǎn)換發(fā)光（Mr/UCL）引導(dǎo)的協(xié)同化療和光動(dòng)力療法通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)該膠束具有良好的生物相容性，具有專一性和優(yōu)良的熒光與磁性。

2.4 藥物運(yùn)輸與釋放

藥物運(yùn)輸通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光與裝載藥物的光響物質(zhì)，形成近紅外激發(fā)的藥物釋放。Zhang等[36]研究出一種具有磁性和上轉(zhuǎn)換性質(zhì)的介孔型稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，通過實(shí)驗(yàn)研究表明該材料可用于藥物的傳輸；Xing等[37]用硅涂層上轉(zhuǎn)換納米粒子自組裝光反應(yīng)共聚物制備了一種納米復(fù)合材料，實(shí)現(xiàn)了近紅外光控制藥物釋放和癌癥治療。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用依舊擁有極大的潛力，發(fā)展前景巨大，研究的趨勢(shì)朝著診療一體化、聯(lián)合治療方向發(fā)展。

3 上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的研究

隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展以及上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，吸引了國(guó)內(nèi)外開始對(duì)上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的研制。

早期，Zijlmans等[15]首次利用氙燈提供近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光粉粒子，采用改進(jìn)型的熒光顯微鏡，通過將配有75 W氙燈的Leica DMR-LB直立型熒光顯微鏡移除KG系列的“熱鏡”和BG-38的“紅阻”但令其團(tuán)隊(duì)發(fā)愁的是后期需要昂貴的儀器來檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的短暫的光。

2006年，Lim等[16]采用20×，0.4 NA物鏡（Nikon，Melville，NY）和一種強(qiáng)度耦合CCD相機(jī)的倒置顯微鏡對(duì)線蟲的上轉(zhuǎn)換發(fā)光進(jìn)行了紅外激發(fā)成像，最后用光纖耦合CCD光譜儀（海洋光學(xué)，Dunedin，F(xiàn)L）采集上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜。

2008年，Chatterjee等[17]采用980 nm的VA-Ⅱ型全固態(tài)態(tài)半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)源（1.0 A)在暗室中觀察到發(fā)光，并用帶有熱濾光片的CCD數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行記錄，以消除近紅外散射。次年Salthouse等[38]研發(fā)第一個(gè)小型動(dòng)物上轉(zhuǎn)換成像儀用于上轉(zhuǎn)換納米粒子體內(nèi)成像，該儀器用980 nm激光二極管（300 mW）作為激發(fā)光，激光被準(zhǔn)直、過濾和擴(kuò)散，圖像由攝像機(jī)拍攝，通過鏡頭組件進(jìn)行聚焦，然后用激光濾光片進(jìn)行濾波。

2009年，Lia等[39]搭建一個(gè)由具有平行板的小動(dòng)物成像室、激光器、具有聚焦光學(xué)器件的Galvo控制光學(xué)掃描器、成像遠(yuǎn)心透鏡和攝像機(jī)組成的系統(tǒng)。將來自激光二極管的光通過適當(dāng)?shù)膸V波器濾波，隨后聚焦到成像室的一個(gè)板的特定斑點(diǎn)上。發(fā)射的熒光信號(hào)用長(zhǎng)通或短程濾波器（分別為Cy5.5或unp）與適當(dāng)?shù)膸V波器相結(jié)合進(jìn)行濾波最后采用高靈敏度的CCD攝像機(jī)采集圖像。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究表明將上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒用于生物活體成像并未受到來自自發(fā)熒光的干擾。

2010年，Xiong等[8]采用改良的Olympus FV1000激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡5對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共聚焦成像，該顯微鏡配有連續(xù)波激光器，波長(zhǎng)為980 nm，采用60×浸油物鏡。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究用β-NaLuF(4)：Gd(3+)，Yb(3+)，Tm(3+)納米晶體作為發(fā)光，實(shí)現(xiàn)了小鼠全身光發(fā)光成像的＜50個(gè)納米標(biāo)記細(xì)胞的檢測(cè)極限。2009年，復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系與復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院[20]搭建一個(gè)上轉(zhuǎn)換納米顆粒用于小動(dòng)物活體成像的系統(tǒng)，在980 nm處發(fā)射的連續(xù)波激光由電流計(jì)反射鏡定向，然后由物鏡（60×浸油物鏡）進(jìn)入標(biāo)本。從掃描點(diǎn)的位置發(fā)射的光被電流計(jì)反射鏡偏轉(zhuǎn)，然后通過反向激發(fā)二向色鏡與激發(fā)分離，然后通過共焦針孔，并最終進(jìn)入光電倍增管（PMT，R6357增強(qiáng)型）作為探測(cè)器。通過實(shí)驗(yàn)研究表明上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像技術(shù)適用于跟蹤和標(biāo)記復(fù)雜生物系統(tǒng)的組件。

近期,芬蘭的Labrox和Hidex公司研究一種上轉(zhuǎn)換熒光探針專用的數(shù)字化顯示讀出設(shè)備[40]；國(guó)內(nèi)針對(duì)上轉(zhuǎn)換實(shí)際應(yīng)用的檢測(cè)設(shè)備研發(fā)方向主要以免疫分析儀為主[41]。如中國(guó)科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所和解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究的上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)生物傳感器、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫試紙掃描檢測(cè)系統(tǒng)[42-43]；中國(guó)解放軍白求恩醫(yī)務(wù)學(xué)校檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教研室研究的基于面陣CCD的便攜式上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析檢測(cè)系統(tǒng)[44]。目前市面缺乏商業(yè)的專門檢測(cè)上轉(zhuǎn)換熒光納米這種材料的設(shè)備，對(duì)于如何進(jìn)一步的開展建立專用針對(duì)檢測(cè)設(shè)備對(duì)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的實(shí)際應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的意義。

4 結(jié)語

由于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的顯著優(yōu)勢(shì)，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的運(yùn)用。然而，目前還未有現(xiàn)成的商業(yè)熒光成像系統(tǒng)，多數(shù)情況仍采用傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)設(shè)備在檢測(cè)過程中由于設(shè)備的信噪比較低使其難以準(zhǔn)確的檢測(cè)，而且傳統(tǒng)的紅外激發(fā)器體積較大使其檢測(cè)系統(tǒng)較為笨重。隨著科技不斷的發(fā)展，政府對(duì)醫(yī)療設(shè)備的不斷關(guān)注與投入以及醫(yī)療市場(chǎng)的需求，未來檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)朝著便攜化、一體化、智能化和全自動(dòng)化發(fā)展。

（1）便攜化。傳統(tǒng)的紅外激發(fā)器為了確保穩(wěn)定性整個(gè)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)較為笨重，可以考慮研發(fā)穩(wěn)定性好而且小巧的紅外激發(fā)光源，或者可以考慮采用無線遠(yuǎn)程對(duì)激光器的智能控制。

（2）一體化。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷的創(chuàng)新與發(fā)展，在今后可以考慮將多種治療方式集合在一個(gè)平臺(tái)上，集合各個(gè)治療方式的優(yōu)勢(shì)，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

（3）智能化。隨著智能設(shè)備的不斷普及以及互聯(lián)大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，今后可以通過互聯(lián)網(wǎng)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，實(shí)時(shí)記錄分析檢測(cè)的結(jié)果，為建立健康服務(wù)平臺(tái)提供數(shù)據(jù)。

（4）全自動(dòng)化。機(jī)器設(shè)備和系統(tǒng)在沒有人或較少人的直接參與下，按照人的要求，經(jīng)過自動(dòng)檢測(cè)、信息處理、分析判斷、操縱控制，實(shí)現(xiàn)預(yù)期的目標(biāo)。