高效液相色譜-切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定左金丸中鹽酸小檗堿及吳茱萸堿含量

敖華蓉，龔春燕

（湖北省宜昌市第二人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443000）

左金丸源自元代朱丹溪《丹溪心法·火六》[1]，由黃連和吳茱萸組方，兩者配伍，有瀉火疏肝、和胃止痛功效，可用于肝火犯胃而見(jiàn)吞酸、胃痛之證[2]，臨床多用于肝火犯胃型急慢性胃炎[3]、反流性食管炎[4]、慢性糜爛性胃炎[5]、腹瀉型腸易激綜合征[6]、膽汁反流性胃炎[7]等胃腸道疾病的治療。黃連 Coptis chinensis Franch．為毛茛科植物黃連的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效，主要成分為鹽酸小檗堿[2，8]。吳茱萸 Euodia rutaecarpa(Juss．)Benth．為蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)，具有散寒止痛、降逆止嘔功效，主要成分為吳茱萸堿[2，9]?，F(xiàn)有報(bào)道多集中于單一成分的研究，或?qū)烧咴谕徊ㄩL(zhǎng)下測(cè)定。對(duì)此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）-切換波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定左金丸中鹽酸小檗堿、吳茱萸堿含量，為其質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1260型HPLC儀，包括Agilent Chem化學(xué)工作站、G4212B型DAD雙波長(zhǎng)切換檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；Ultimate AQ C18色譜柱(月旭科技 ＜上海＞股份有限公司)；AG135型電子分析天平（瑞士 Mettler-Toledo公司）；BP121S型電子分析天平（德國(guó) Sartorius公司）；KQ-300ES型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為 110713-200609）、吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)為110802-200606)，供含量測(cè)定用，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；左金丸（廈門(mén)中藥廠(chǎng)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z35020033，批號(hào)分別為20160406，20160510，20161812，規(guī)格為每 12 丸約 1 g）；乙腈、十二烷基硫酸鈉溶液、磷酸、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Ultimate AQ C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-1．5 mmol／L 十二烷基硫酸鈉溶液（以磷酸調(diào) pH 至 5．0，B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表 1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：鹽酸小檗堿為265 nm、吳茱萸堿為225 nm；流速：1 mL ／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2．2 溶液制備

稱(chēng)取鹽酸小檗堿、吳茱萸堿對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成兩者質(zhì)量濃度分別為 450 μg／mL和560 μg／mL的溶液，即得混合對(duì)照品溶液。稱(chēng)取樣品適量，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率為250W，頻率為40kHz）處理45min，放至室溫，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，得溶液1；精密吸取該溶液10 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng) 0．45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按左金丸處方制備缺黃連、吳茱萸藥材的陰性對(duì)照樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液適量，按2．1項(xiàng)下色譜條件分別在波長(zhǎng)為265 nm和225 nm時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)應(yīng)不小于3 000，以吳茱萸堿峰計(jì)應(yīng)不小于4 000，分離度均大于1．5。

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2．2項(xiàng)下供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液適量，按2．1項(xiàng)下色譜條件分別在波長(zhǎng)為265 nm和225 nm時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。在265 nm波長(zhǎng)處鹽酸小檗堿陰性對(duì)照無(wú)干擾，在225 nm波長(zhǎng)處吳茱萸堿陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專(zhuān)屬性良好。

耐用性試驗(yàn)：依法制備供試品溶液，分別改變色譜柱品牌及型號(hào)、柱溫、流速，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，在一定條件下，改變色譜柱品牌及型號(hào)、柱溫、流速，不影響樣品含量測(cè)定。

圖1 高效液相色譜

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

線(xiàn)性關(guān)系考察：分別各稱(chēng)取鹽酸小檗堿、吳茱萸堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，以甲醇溶解，制成鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為 0，2．25，4．50，22．50，112．50 μg ／mL，吳 茱 萸 堿 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 0，2．80，5．60，28．00，140．00 μg／mL 的系列單一對(duì)照品溶液。按 2．1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得鹽酸小檗堿、吳茱萸堿回歸方程分別為Y＝27 409X-1 063，r＝0．999 6（n＝5）；Y′＝18 075X′-1 326，r＝0．999 3（n＝5）。鹽酸小檗堿、吳茱萸堿質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為 2．25～112．50 μg／mL 和 2．8～140．0 μg ／mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品溶液適量，共6份，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、吳茱萸堿峰面積的 RSD分別為 1．15%，1．39%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液（批號(hào)為20160510）適量，分別于室溫下放置 0，2，4，12，24，36 h時(shí)按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、吳茱萸堿峰面積的 RSD為1．43%和1．26%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置36 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20160510）適量，依法制備供試品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、吳茱萸堿峰面積的 RSD為1．07% 和 1．54%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為20160510）適量，共12份，分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿、吳茱萸堿對(duì)照品溶液（各6份），依法制備供試品溶液，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

2．4 樣品含量測(cè)定

分別稱(chēng)取不同批號(hào)的樣品適量，依法制備供試品溶液，按 2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 10 μL，測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿和吳茱萸堿的峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表 4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）

3 討論

3．1 流動(dòng)相選擇

預(yù)試驗(yàn)中，參考文獻(xiàn)[10-11]，考察了乙腈（A）-1．5 mmol／L 十二烷基硫酸鈉溶液、乙腈（A）-1．5 mmol／L十二烷基硫酸鈉溶液（以磷酸調(diào) pH至5．0）- 水（含 0．05% 甲酸）- 乙腈（B）、乙腈 -0．04% 磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸小檗堿、吳茱萸堿色譜峰的出峰情況。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈（A）-1．5 mmol／L十二烷基硫酸鈉溶液（以磷酸調(diào)pH至 5．0）時(shí)，上述2種成分峰形完整、清晰可辨。

3．2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

預(yù)試驗(yàn)中采用全波長(zhǎng)掃描法，將供試品溶液置0～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在265 nm和225 nm波長(zhǎng)時(shí)，鹽酸小檗堿、吳茱萸堿均有色譜峰出現(xiàn)，但265 nm波長(zhǎng)處吳茱萸堿峰形雜亂、不明顯，而鹽酸小檗堿峰形尖銳，圖形對(duì)稱(chēng)，保留時(shí)間適中；225 nm波長(zhǎng)處鹽酸小檗堿峰形易受其他物質(zhì)干擾，而吳茱萸堿則峰形完整、清晰，周?chē)鸁o(wú)雜峰。因此選擇雙波長(zhǎng)測(cè)定上述2種成分，保證了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

3．3 pH 選擇

用反相離子對(duì)色譜法分析堿性成分時(shí)，堿性成分的色譜行為會(huì)隨流動(dòng)相pH的變化而有較大改變[12]。預(yù)試驗(yàn)中考察了不同 pH（3．5，5．0，6．5）對(duì)鹽酸小檗堿、吳茱萸堿色譜行為的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH較低時(shí)（pH≤3．5），各色譜峰出峰時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，其原因可能與離子對(duì)的穩(wěn)定常數(shù)有關(guān)；當(dāng)pH較高時(shí)（pH≥6．5），上述2種成分色譜峰未能達(dá)到完全基線(xiàn)分離，部分色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)性差；當(dāng)pH為5．0時(shí)，各色譜峰分離效果較好，峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)性好，保留時(shí)間適中，有利于供試品溶液的分析測(cè)定。因此以磷酸調(diào)流動(dòng)相pH至5．0。

3．4 洗脫條件選擇

預(yù)試驗(yàn)中考察了等度洗脫和不同比例的梯度洗脫，最終確定，在上述梯度洗脫程序下，40 min內(nèi)可檢出供試品溶液中的鹽酸小檗堿及吳茱萸堿。

綜上所述，本研究中建立的HPLC-切換波長(zhǎng)法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為制訂左金丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。