高效液相色譜法測(cè)定余甘子提取物中沒食子酸與鞣花酸含量

張文莉 ，張俊儀 ，張龍開，黃月純，林偉斌，梁芷韻 ，魏 剛

（1．無(wú)限極 ＜中國(guó) ＞有限公司，廣東 江門 529156； 2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510006； 3．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405； 4．廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006）

余甘子為大戟科植物余甘子 Phyllanthusemblica L．的干燥成熟果實(shí)，有清熱涼血、消食健胃、生津止渴功效，常用于治療血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉嚨痛及口干[1]。余甘子富含酚類、維生素、氨基酸、黃酮等生物活性物質(zhì)[2]，主要有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化[6]、免疫調(diào)節(jié)等[7]藥理作用。近幾年的研究主要集中在藥物效應(yīng)學(xué)與食品和保健品開發(fā)[8]。目前，余甘子藥材的質(zhì)量控制方法主要有2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載的高效液相色譜（HPLC）法[1]。研究表明，余甘子藥材的質(zhì)量與其來源、產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候、土壤等生長(zhǎng)條件及采收加工方法關(guān)系較大[9-10]，提示藥典僅通過檢測(cè)沒食子酸含量控制余甘子質(zhì)量專屬性不強(qiáng)。除沒食子酸外，余甘子尚含較多的鞣花酸、柯里拉京等多種酚酸類成分，采用特征指紋圖譜進(jìn)行分析能更好地對(duì)余甘子進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[11-13]。余甘子提取物是由余甘子提取加工而成，常用作于藥品、保健品的原料。本研究中參考藥典余甘子標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法及文獻(xiàn)記載方法，對(duì)余甘子提取物中沒食子酸和鞣花酸含量進(jìn)行測(cè)定，為評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀（包括二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；KQ-400 KDE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。10批余甘子提取物（編號(hào)S1～S10，來源見表1）；余甘子藥材，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)魏剛研究員鑒定為大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblical．的干燥成熟果實(shí)；沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110831-201605，純度為 89．9% ），鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)為111959-201602，純度為 89．3%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（Merck公司，色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 沒食子酸含量測(cè)定

2．1．1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB Aq 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0．2%磷酸溶液 （B）系統(tǒng)，梯度洗脫，0～10 min，A 為 2% →10% ，10～15 min，A 為 10% →20% ，15～20 min，A 為 20% →30% ，20～25 min，A 為30%→40%，25～35 min，A 為 40%→60%，35～40 min，A為60%→90%；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；柱溫：30℃；流速：1．0 mL ／min；進(jìn)樣量為 10 μL。

表1 余甘子提取物樣品來源

2．1．2 溶液制備

取樣品粉末0．2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲(功率為320 W，頻率為40 kHz)提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含0．282 mg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取 2．1．2 項(xiàng)下 2 種溶液，按 2．1．1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果色譜峰分離度良好，峰形尖銳，符合含量測(cè)定要求(見圖1 A和圖1 B)。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2．1．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液 1，2，5，10，15 μL，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝2 914．6 X-15．21，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，沒食子酸進(jìn)樣量在 0．282～4．230 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0．03%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品（S1）溶液10 μL，分別在室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0．11%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密稱取同一批樣品（S2）6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均含量為37．15 mg／g，RSD 為 0．68% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取6份已知含量的樣品（S2，含水分 3．15% ，按干燥品計(jì)算含量為 38．36 mg ／g），每份約0．1 g，精密稱定。然后分別精密加入一定量的對(duì)照品，依法制備供試品溶液，按2．1．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2．2 鞣花酸含量測(cè)定

2．2．1 色譜條件

色譜柱：ZorbaxSB Aq 柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0．2% 磷酸溶液（B）系統(tǒng)，梯度洗脫，0～10 min時(shí)A為40%→60%，10～15 min時(shí)A為60%→90%，15～20 min時(shí)A為90%；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1．0 mL ／min；進(jìn)樣量 10 μL。

2．2．2 溶液制備

取樣品粉末0．2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取鞣花酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含鞣花酸0．043 6 μg 的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取 2．2．2 項(xiàng)下 2 種溶液，按 2．2．1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果色譜峰分離度良好，峰形尖銳，符合含量測(cè)定要求(見圖1A′和圖1B′)。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2．2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液 1，2，5，10，15 μL，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝9 054．5 X-9．077，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，鞣花酸進(jìn)樣量在 0．043 6～0．654 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0．26%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品（S1）溶液10 μL，分別在室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0．38%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密稱取同一批樣品（S2）6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均含量為13．52 mg／g，RSD 為 0．43% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取6份已知含量的樣品（S2，含水分 3．15% ，按干燥品計(jì)算含量為 13．52 mg ／g），每份約為0．1 g，精密稱定，然后分別精密加入一定量的對(duì)照品，依法制備供試品溶液，按2．2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表2 沒食子酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 鞣花酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．3 樣品含量測(cè)定

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5～10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，外標(biāo)法測(cè)定含量。結(jié)果見表4。

表4 余甘子提取物含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）

3 討論

2015年版《中國(guó)藥典（一部）》余甘子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，采用HPLC法測(cè)定沒食子酸含量時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm，本研究中以此測(cè)定余甘子中沒食子酸含量。而測(cè)定余甘子中鞣花酸含量的檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm是參考文獻(xiàn)確定的。

由于其酚酸類成分極性差異大，不同溶劑對(duì)沒食子酸、鞣花酸提取效果差異較大。本試驗(yàn)中分別以不同體積分?jǐn)?shù)甲醇為溶劑考察對(duì)沒食子酸和鞣花酸提取效果的影響，結(jié)果顯示，50%甲醇對(duì)沒食子酸提取效果明顯優(yōu)于其他體積分?jǐn)?shù)甲醇。而鞣花酸以甲醇為溶劑時(shí)提取率較高。本研究中參考2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]及文獻(xiàn)[3]，擬訂分別以50%甲醇和甲醇為溶劑制備供試品溶液測(cè)定2種成分的含量。同時(shí)對(duì)2種成分的超聲時(shí)間（45，60，75 min）及取樣量（0．1，0．2，0．3 g）進(jìn)行了優(yōu)化篩選。結(jié)果顯示，提取時(shí)間和取樣量的改變對(duì)沒食子酸、鞣花酸的提取率均無(wú)明顯影響，故確定采用將提取物粉末0．2 g加入相應(yīng)溶劑50 mL超聲提取60 min的方法制備供試品溶液。

沒食子酸和鞣花酸極性差異較大，采用梯度洗脫可同時(shí)測(cè)定其含量[3]，因所用溶劑不同，故對(duì)鞣花酸測(cè)定的流動(dòng)相梯度進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，縮短了保留時(shí)間。加樣回收試驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證表明，所建立的方法簡(jiǎn)便可行。

根據(jù)含量測(cè)定結(jié)果判定，10批樣品中有2批為未知偽品，其沒食子酸與鞣花酸含量均為0。8批正品含量差異較大，沒食子酸含量為 12．79～105．07 mg／g，鞣花酸含量為 3．09～33．47 mg／g，最高與最低含量的差分別達(dá)8倍和10倍，提示市場(chǎng)上余甘子提取物質(zhì)量差異較大。由于沒食子酸的專屬性相對(duì)較差，而藥典余甘子標(biāo)準(zhǔn)僅以沒食子酸含量作為定量指標(biāo)，提示藥典余甘子質(zhì)量控制指標(biāo)專屬性不強(qiáng)。本試驗(yàn)中所采用的沒食子酸結(jié)合鞣花酸含量測(cè)定方法，能更好地控制余甘子提取物的質(zhì)量。

文獻(xiàn)對(duì)余甘子提取物的偽品報(bào)道較少，檢出的2批偽品暫未能確定其來源。但即使是正品，不同廠家產(chǎn)品含量差異也比較大，主要可能與藥材來源、制備工藝等相關(guān)。因此，應(yīng)加強(qiáng)原料質(zhì)量控制，規(guī)范穩(wěn)定的制備工藝，才能更好地保障提取物質(zhì)量的穩(wěn)定性。