山楂藥材黃酮類成分毛細管電泳指紋圖譜研究

陳寶龍，鄭朝華，陳玉英

（1．河南省正骨研究院，河南 洛陽 471002； 2．中國藥科大學分析化學教研室，江蘇 南京 210009）

中藥山楂有行氣散瘀功效[1]，臨床治療關節扭傷和紅腫熱痛效果良好[2-3]。山楂所含山楂總黃酮在體內外均能抑制血小板聚集，山楂葉醇提物（主要為黃酮類成分）對模型小鼠有抗炎鎮痛作用，黃酮類代表成分金絲桃苷和蘆丁有顯著的抗炎鎮痛作用[4-7]。山楂在我國分布廣泛，成分及含量不盡相同，藥效也有差異。為控制藥材和制劑質量，保證藥效，需對山楂中的化學成分物質群進行控制[8]。本研究中依據《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南（試行）》的要求，利用毛細管電泳（CE）技術建立山楂藥材黃酮類成分的指紋圖譜，考察該圖譜用于控制山楂藥材質量的可行性，并為其質量控制標準的建立進行有益探索。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：D／ACE5500型毛細管電泳儀[配有二極管陣列檢測器（DAD）](美國Beckman公司)；毛細管柱（河北永年光纖廠，總長 57 cm，有效長度 50cm，內徑 50 μm，未涂漬）。

試藥：10批次山楂藥材來自山東濟南，經藥物室李軍研究員鑒定為薔薇科植物山里紅 Crataegus pinnatifida Bge．var．major N．E．Br的干燥成熟果實；金絲桃苷對照品（≥95%）購于安徽DETLA天然有機化合物信息中心；十二烷基硫酸鈉（SDS，Sigma公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 檢測條件

電泳模式：膠束電泳毛細管色譜（MECC）模式；緩沖液：NaH2PO4-Na2B4O7-SDS（濃度分別為 20，40，40 mmol／L，pH＝4．50）；毛細管柱處理：依次用重蒸水、0．1 mol／L氫氧化鈉、重蒸水沖洗毛細管柱各10 min，緩沖液沖洗 5 min，平衡20 min，緩沖液沖洗5 min，高壓進樣6 s，25 kV 電壓分析樣品 60 min；檢測波長：210 nm。

2．2 溶液制備

采用前期試驗確定的黃酮類成分提取方法[9]，稱取山楂藥材樣品粉末1．25 g，加10倍量95%乙醇，60℃、250 W超聲提取 45 min，濾過，殘渣加 6倍量 95%乙醇，同法超聲提取，濾過，殘渣加4倍量95%乙醇，再次同法超聲提取，濾過，合并濾液，轉至25 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，搖勻；移取3 mL提取液，加熱揮干溶劑，加 1 mL 緩沖液超聲溶解，放置 30 min，經 0．45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取對照品金絲桃苷適量，用緩沖液超聲溶解，放置 30 min后，經 0．45 μm微孔濾膜濾過，作為對照品溶液（質量濃度為25 μg／mL）。

2．3 方法學考察

空白及對照品試驗：分別取緩沖液、金絲桃苷對照品溶液，壓力進樣，記錄色譜圖。結果見圖1。

參照物選擇：經出峰時間和DAD比對，確認8號峰為金絲桃苷峰，其峰面積較大、峰形好、峰純度高，故被選為參照物。

精密度試驗：取供試品溶液（批次 5），連續進樣5次。結果峰面積百分比≥10%的共有峰相對峰面積的RSD為2．30%（＜5%），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：精密稱取供試品（批次 5）6份，照2．2項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果峰面積百分比≥10%的共有峰相對峰面積的 RSD為2．42%（＜5%），表明方法重復性較好。

圖1 空白及對照品試驗色譜圖

穩定性試驗：取同一供試品溶液（批次5），分別在室溫下放置 0，4，8，12，16 h時進樣。結果峰面積百分比≥10%的共有峰相對峰面積的 RSD為 2．32%（＜5%），表明供試品溶液在室溫下放置16 h內穩定。

2．4 毛細管柱處理

新毛細管柱用 1 mol／L鹽酸、重蒸水、1 mol／L氫氧化鈉、重蒸水交替沖洗處理，充滿氮氣保存待用；每天試驗開始前用1 mol／L氫氧化鈉沖洗5 min，重蒸水沖洗10 min，緩沖液沖洗30 min；試驗結束前用 1 mol／L氫氧化鈉沖洗 20 min，重蒸水沖 20 min，充滿氮氣，保存待用。

2．5 指紋圖譜的建立及分析

指紋圖譜的建立：根據10批次山楂藥材樣品的CE檢測結果所給出的相關參數，比較圖譜可知，有16個共有峰，其中，金絲桃苷峰（8號峰）峰面積較大，純度高，被選為參照峰。在共有峰中只有15號峰的峰面積大于總峰面積的10%，因此只考慮15號峰的峰面積比值，其余各共有峰均按其相對保留時間進行定性。山楂藥材樣品的 CE指紋圖譜見圖2。10批次山楂藥材樣品中黃酮類成分CE指紋圖譜共有峰（1～16 號峰）的相對保留時間比分別為 0．566，0．585，0．637，0．674，0．742，0．769，0．861，1．000（s），1．079，1．177，1．248，1．500，1．532，1．605，1．683，2．317。 指紋圖譜峰面積百分比≥10%的共有峰(峰15)的相對峰面積見表1。

圖2 山楂藥材黃酮類成分的CE指紋圖譜

指紋圖譜全譜相似度比較與分析：根據《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術指南（試行）》的要求，采用計算機輔助相似性評價系統，比較10批次山楂藥材樣品黃酮類成分CE指紋圖譜全譜相似度。技術參數見表2。

表1 10批次山楂藥材樣品中峰15的相對峰面積

表2 10批次山楂藥材樣品的相似度評價技術參數

3 討論

CE是利用不同物質在處于高電場且充滿溶液的毛細管中遷移速率不同實現彼此分離，具有柱效高、分離快、適用樣品范圍廣、樣品使用量少的優點，在許多領域已成為重要的分析手段。中藥有效成分多、含量低的特點適合采用CE方法進行質量控制。在本研究中，分析條件的選擇和優化是關鍵。

介質選擇：山楂藥材中要考察的有效部位為黃酮類成分，根據其結構大多含有鄰位酚羥基的特點，并參考文獻[10-12]，選擇硼砂水溶液作為基本電解質，以利用硼砂與鄰位酚羥基的絡合作用使不同成分淌度差異拉大，使分離度增加，提高CE的選擇性。

對照品選擇：在已知山楂黃酮類成分中，金絲桃苷含量高，故以金絲桃苷作為對照品。

分析樣品溶液制備：CE是一種高靈敏度的分析方法，為符合MECC的分析要求，使分析樣品在進樣前與緩沖液中的組分形成穩定的膠束包裹物，同時消除分析過程中分析樣品溶液時產生的擾動，提高分離效率，分析樣品溶液采用緩沖液制備。

檢測波長選擇：對供試品溶液進行190～800 nm紫外-可見吸收光譜掃描和DAD成分檢測，因210 nm波長處黃酮類成分有顯著吸收，且檢測到的峰多，分離度較好，故選定210 nm為CE測定波長。

CE分析模式選擇：為獲得最佳的山楂藥材CE指紋圖譜，先后考察了MECC相CZE（毛細管區帶電泳）和pH梯度法3種CE分析模式。結果顯示，采用緩沖液制備的供試品溶液在MECC模式得到的CE圖譜較另兩種模式圖譜出峰多，峰之間的分離度相對較好，基線相對較平穩，故選用MECC分析模式。

參照物選擇：由加入一定量金絲桃苷對照品的供試品溶液的CE圖譜確定8號峰為金絲桃苷峰，其峰面積大、峰形好、峰純度高，故被選為參照物。

測定條件優化：為獲得最佳的山楂藥材CE指紋圖譜，對 CE 分析條件的電壓（10，15，20，25，30 kV）、進樣方式（壓力進樣、電壓進樣）、緩沖液pH（通過加入 NaH2PO4調控 pH 為 4．0，4．5，5．0，6．0）、緩沖液濃度（10∶20∶20，10∶20∶40，20∶40∶40，20∶40∶30，mmol／L），有機添加劑（異丙醇、乙腈或不添加）進行了優化考察，通過比較圖譜，確定了本研究中采用的測定條件。

綜上所述，雖然山楂藥材黃酮類成分CE指紋圖譜研究未見報道，但本研究中成功建立的CE指紋圖譜技術為山楂質量控制提供了參考。