利用DNA分子指紋圖譜技術檢測小麥粉中害蟲的研究

魯玉杰 袁 園 劉鳳杰 王爭艷 何向楠

(河南工業大學糧油食品學院；河南省小麥儲藏協同創新中心 ，鄭州 450001)

小麥粉中害蟲碎片的數量是面粉質量等級的劃分的重要指標。在國際貿易中銷售的不同等級的小麥粉中害蟲碎片的含量在各個國家有不同的規定，加拿大健康保護協會規定每50 g小麥粉樣品中含有少于20個大于0.2 mm的昆蟲碎片[1]。而美國食品和藥物管理局規定禁售程度為每50 g小麥粉中含有75個或更多的昆蟲碎片[2]。在歐洲，對小麥粉中害蟲碎片的量也有一些限制。近年來，夏季面粉廠最頭疼的是面粉蟲害問題[3]。小麥粉生蟲還嚴重影響面粉的質量和出口貿易[4]。目前害蟲數量的檢測方法沒有統一的標準。染色法[3]、近紅外光譜檢測法[5]、磷鎢酸檢測尿酸法[6]、浮選法[7]、酶聯免疫吸附測定法[8]、高效液相色譜法[9]等是近幾年研究的熱點，但目前還沒有一種快速準確的方法并在實際中得到推廣。DNA(脫氧核糖核酸)是細胞染色體中的遺傳基因，其分子各個片段就代表各個遺傳信息[10]。由于DNA指紋圖譜直接反映DNA水平上的差異，它成為當今應用廣泛的遺傳標記系統。目前，DNA指紋技術在昆蟲領域的應用主要集中在系統演化及分類鑒定兩方面[11-12]。Balasubramanian等[13]利用DNA指紋技術能夠檢測小麥粉中赤擬谷盜和雜擬谷盜成蟲的碎片，其靈敏度為小麥粉中1.0%的害蟲感染水平。本研究為開發小麥粉中快速有效的檢測害蟲的技術，利用了昆蟲的延長因子基因EF1為目的基因的DNA分子指紋圖譜技術對小麥粉中的常見的赤擬谷盜Triboliumcastaneum、雜擬谷盜Triboliumconfusum和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis的碎片、幼蟲和卵進行了檢測，并抽取了面粉廠中樣品對其幼蟲含量進行了靈敏度和準確率的驗證。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蟲源

試蟲赤擬谷盜Triboliumcastaneum，雜擬谷盜Triboliumconfusum和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis采自河南省鄭州市，在河南工業大學儲糧生態實驗室培養數代后備用。選用蟲齡、生理狀態一致的赤擬谷盜、雜擬谷盜、鋸谷盜(成蟲、幼蟲和蟲卵)。赤擬谷盜和雜擬谷盜的飼料為全麥粉∶碎麥粒∶酵母(9∶3∶1)；鋸谷盜的飼料配比為：全麥粉∶碎麥粒∶燕麥片∶酵母(5∶3∶3∶1)。在溫度(30±2) ℃，濕度(70±5)%的培養箱中培養。

1.1.2 供試小麥粉

選用無蟲且品質較好的小麥，將其除去雜質后用自來水洗干凈，放入烘箱中60 ℃烘2～3 h，將小麥的含水量調至(14±0.5)%。將小麥取出冷卻至室溫，用實驗室小麥磨粉機磨成小麥粉。小麥粉經過80目篩子，篩去大于80目篩孔的小麥粉或面團，篩下物即為所需的小麥粉樣品。一部分小麥粉用于所需蟲源的飼料，一部分作為DNA提取時所需的小麥粉樣品。

1.2 方法

1.2.1 兼并引物設計

以鞘翅目模式昆蟲赤擬谷盜的延長因子(GB：HM156722.1 ；GI：299152241)基因序列為模板，在NCBI中找到赤擬谷盜的基因序列，找出其編碼序列。將基因的編碼序列在NCBI中進行BLAST比對，在比對結果中挑選不同的昆蟲的序列。利用Clustalx軟件選取出相同的基因序列，兼并引物的設計在18～22個堿基，同一列不同的堿基用其他的字母代替，不同的引物組合如表1所示。

1.2.2 不同的昆蟲基因組的提取

從赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜中提取的基因組，采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物(上海)有限公司生產]說明書，其方法步驟略。

1.2.3 PCR反應條件

不同昆蟲PCR反應的條件按照梯度PCR進行條件的設定，然后得到一個確定的反應條件赤擬谷盜不同蟲態的反應條件為：94 ℃，預變性5 min；94 ℃，變性30 s和56 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s的35個循環；72 ℃，延伸10 min；16 ℃保溫1 h之內放入4 ℃的冰箱保存或者進行下一步實驗。雜擬谷盜、鋸谷盜不同蟲態的PCR反應條件與赤擬谷盜條件基本一致，改良PCR反應條件將退火溫度分別為改為48和50 ℃。

1.2.4 簡并引物的篩選

從培養的雜擬谷盜和鋸谷盜試蟲中分別挑選數頭成蟲、幼蟲和蟲卵放入干凈的培養皿內。成蟲和幼蟲清水洗凈放入吸水紙吸干；往放有蟲卵的培養皿內加入少量乙醇潤濕，再加入適量稀硫酸(1∶19=V∶V)蓋上培養皿，放置于水浴鍋上蒸汽浴8 min，蟲卵表面的面粉被去掉，用布氏漏斗低壓抽濾，室溫晾干。用天平稱取50 mg小麥粉和占50 mg小麥粉總量的20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%的不同昆蟲蟲態。稱量的昆蟲放入1.5 mL的無菌離心管中，離心管蓋上蓋子放入盛有液氮的小容器內，放置3～5 min使之冷卻。然后取出離心管并打開蓋子使用組織研磨器進行研磨至粉末狀，最后往離心管內加入稱取的50 mg小麥粉混勻，每種處理重復3次。

1.2.5 不同質量比例的目的基因條帶亮度值

以50 mg小麥粉為準，分別將占20%、10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%和0.05%等的不同比例且不同蟲態的害蟲添加入小麥粉中，提取害蟲的目的基因并且進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳。利用Tanon-2500凝膠成像分析儀和GIS-1D圖像分析軟件計算電泳圖中目的基因條帶的灰度值作為條帶亮度的定量值，計算出害蟲含量與條帶亮度的關系曲線。

1.2.6 DNA指紋檢測方法在面粉廠隨機抽樣檢驗

在鄭州金苑面粉有限公司的倉庫隨機抽取幾袋小麥粉，每一袋小麥粉中抽取500 g放在實驗室里，共抽取7份，每份樣品從抽取的面粉放在溫度(30±2) ℃，濕度(70±5)%的培養箱中培養30 d后再分成兩份，一份進行DNA指紋圖譜方法面粉蟲蟲卵的檢測，另一份利用篩選法對面粉中的幼蟲進

表1 赤擬谷盜延伸因子十對兼并引物的序列

注：M：DNA Marker，DL1000 1-12：分別以赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜為模板表示50～60 ℃的3溫度梯度。圖1 不同引物組合在不同溫度下的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

行檢測得到實際的檢測數量。對比DNA指紋圖譜方法的害蟲含量與條帶亮度的關系方程計算理論的檢測量與時間的檢測數量進行比較。

2 結果與分析

2.1 三種害蟲延長因子基因片段擴增引物的篩選

10對引物相互組合后按照梯度PCR的方法優化對三種小麥粉中主要害蟲赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜延長因子基因片段進行擴增，結果如圖1所示。

從圖1可以看出引物EFS319和EFA758組合的PCR產物中，每個退火溫度的擴增條帶都非常清晰，條帶大小符合目的片段且幾乎沒有引物二聚體和非特異性擴增，說明EFS319和EFA758這對引物可以有效擴增出來特異性條帶，可以用于后續實驗。因此確定本研究延長因子的正向引物EFS319：5′CGT GA(A/G) CGT GGT ATC ACC AT(T/C)G3′。反向引物EFA758：5′CCC TTG AAC CA(T/G) GGC AT(T/C) TTG 3′

2.2 DNA指紋技術檢測小麥粉中三種害蟲成蟲碎片的最低檢出限

小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜成蟲碎片、幼蟲和卵。DNA指紋技術檢測后的電泳圖如圖2所示。

注：M為DL1000 Marker，其條帶片段長度分別為：1 000、700、500、400、300、200和100 bp；1泳道為其目的基因片段；2～7依次是昆蟲碎片含量為20%、10%、5%、3%、2%和1%；8是小麥粉的基因片段；CK為空白對照，是在PCR體系中以無菌水代替目的基因的對照組，主要用作排除底物污染的確定。B和C為優化PCR反應條件后雜擬谷盜和鋸谷盜的檢測結果圖圖2 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)碎片DNA檢測靈敏度

由圖2可知，當成蟲碎片含量占20%時能檢測到，直到碎片含量占2%時仍能檢測，但當赤擬谷盜碎片含量為1%時凝膠成像圖中沒有條帶。對PCR條件優化后可以檢測雜擬谷盜、鋸谷盜碎片含量的最低檢測限為1%。

2.3 DNA指紋技術檢測小麥粉中三種害蟲幼蟲的最低檢出限

在小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜幼蟲。DNA指紋技術檢測后的電泳圖如圖3所示。從圖3可以看出赤擬谷盜幼蟲含量最低檢測限是1%。對PCR條件優化后可以檢測出雜擬谷盜、鋸谷盜的幼蟲含量最低達到0.05%。說明了DNA指紋檢測技術可以準確判斷小麥粉中幼蟲的發生情況。

注：M為DL1000 Marker；1泳道為其目的基因片段；A中2～8依次為赤擬谷盜幼蟲含量為20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，9為小麥粉的目的基因；B和C中2～10依次是幼蟲含量20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%， B和C為優化PCR反應條件的檢測結果；11為小麥粉的目的基因；CK為空白對照。圖3 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)幼蟲DNA檢測結果

2.4 DNA指紋技術檢測小麥粉中三種害蟲蟲卵的最低檢出限

在小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜蟲卵。DNA指紋技術檢測結果如圖4所示。從圖4可以看出赤擬谷盜蟲卵含量最低檢測限是1%。對PCR條件優化后可以檢測出來雜擬谷盜和鋸谷盜的卵最低的可以達到0.05%。說明了DNA指紋檢測技術可以準確判斷小麥粉中蟲卵的發生情況。

注：M為DL1000 Marker；1泳道為其目的基因片段；A中2～7依次為赤擬谷盜卵的含量為20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，8為小麥粉的目的基因；B和C中2～10依次為的雜擬谷盜和鋸谷盜卵含量20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%(PCR優化條件后檢測結果)；11為小麥粉的目的基因；CK為空白對照。圖4 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)卵DNA檢測靈敏度

2.5 DNA指紋圖譜亮度與小麥粉中不同害蟲碎片含量的相關性

將占50 mg小麥粉中含有不同含量的害蟲碎片進行DNA檢測，檢驗后的電泳條帶進行亮度分析，得出害蟲碎片含量與電泳條帶亮度的線性關系如圖5所示。

圖5 小麥粉害蟲碎片含量與DNA電泳條帶亮度的關系

由圖5可知，DNA電泳條帶亮度(Y)與害蟲碎片含量(X)呈良好的相關關系。回歸方程為：Y=858.36X+74.540(r=0.961 9)。說明可以根據目的基因的瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度預測小麥粉中成蟲的數量。

2.6 DNA指紋檢測方法在面粉廠成蟲檢測中應用

為了檢驗DNA分子指紋圖譜檢測害蟲的準確性，在面粉廠隨機取了7份小麥粉，用DNA指紋技術測定成蟲碎片的含量的檢測，根據實際害蟲發生的情況，利用害蟲含量與條帶亮度的關系進行了預測，檢測值和預測值的結果比較如表2所示。

從表2可以看出：當成蟲數量大于12以上才能檢測出條帶亮度。隨機取樣的小麥粉中害蟲的數量多，條帶亮度值越高；而且條帶亮度值隨著實際害蟲的數量增加而增加，說明了通過檢測目的基因的條帶亮度可以初步推測樣品中害蟲的感染程度。利用DNA指紋技術測定7份小麥粉樣品的害蟲含量與實際發生量相比，準確率均在66.67%～80.56%。結果說明了利用DNA指紋技術測定的小麥粉害蟲含量可以預測小麥粉中害蟲的感染程度，但是檢測的準確率有待提高。

表2 隨機7份小麥粉30 d后DNA指紋技術檢測和

注：表中“-”表示沒有檢測結果。

3 討論

Bennett[14]利用DNA指紋技術檢測水稻抗病蟲害的結果說明DNA指紋技術已經提供了關于昆蟲和病原菌群體結構獨特的信息。因此可以利用儲糧昆蟲具有基因結構的獨特性，采用DNA指紋技術進行害蟲的檢測。Balasubramanian等[13]設計了兩對不同的兼并引物，用DNA指紋技術研究了小麥粉中赤擬谷盜和雜擬谷盜的碎片，其結果為害蟲碎片的最低檢出限為1%。本研究采用一對通用引物可檢測小麥粉中三種不同的害蟲，實驗操作簡單、成本低廉。且幼蟲和蟲卵的檢測靈敏度顯著高于成蟲碎片的檢測。在檢測小麥粉中赤擬谷盜成蟲、幼蟲和卵時應用的PCR擴增條件的退火溫度是56 ℃，在檢測小麥粉中的雜擬谷盜和鋸谷盜時改良的PCR擴增時的退火溫度分別為48和50 ℃，因此檢測出赤擬谷盜成蟲碎片時的最低檢出限為2%，而對雜擬谷盜和鋸谷盜的最低檢出限為1%。而且改良后的PCR條件可以提高幼蟲和卵的檢出限。說明了在DNA指紋技術檢測時PCR擴增的條件優化非常關鍵。

本研究還發現不同害蟲碎片含量與DNA片段電泳條帶亮度成正相關。對隨機取樣的面粉檢測結果與實際結果準確率最高可達80.56%。說明DNA指紋圖譜技術可以預測小麥粉中三種害蟲感染程度，但是檢測的準確率有待提高。在以后的研究中DNA指紋技術不僅可用于定性還可以提高定量的準確性。在應用中可以開發一種快速檢測的試劑盒，對于快速檢測成品糧中害蟲的發生具有重要的指導意義。

4 結論

利用DNA分子指紋圖譜技術檢測成蟲碎片、幼蟲和蟲卵檢測限分別為1%、 0.05%和1%。說明此方法可以檢測成蟲碎片、幼蟲和卵。根據不同害蟲碎片含量(X)檢測出來DNA片段電泳條帶亮度(Y)之間的關系Y=858.36X+74.540(r=0.961 9)，說明兩者存在明顯的相關性。利用DNA檢測技術檢測從面粉廠隨機抽取的樣品，發現實際結果和DNA檢測結果準確率可達80.56%。說明可以利用DNA分子指紋圖譜技術預測小麥粉中害蟲的感染程度。