蒙脫石鹽酸倍他洛爾固體脂質納米粒的制備及理化性質考察

趙雅文，李 娟，田雙艷，韓鑫玥，李 薇，侯冬枝*，陳燕忠，呂竹芬，段豪云，周慶軍

(1.廣東藥科大學藥學院，廣東省局部精準遞藥制劑工程技術研究中心，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州 510006；2.廣州市藥品檢驗所，廣州 510160；3.山東省眼科研究所，青島 266071)

青光眼(Glaucoma)是以眼壓異常升高、視神經功能受損等為特點的眼科常見疾病[1-2]，青光眼在全球的發病率為3.54%，其中亞洲和非洲為高發病區[3]。目前，青光眼的康復治療依然是以降低眼內壓為主要途徑，主要方法有抗青光眼藥物治療、laser治療和臨床手術，其中使用抗青光眼藥物為首選治療方法。在藥物治療中，滴眼劑是治療眼部疾病的首選，常用的滴眼劑存在眼部刺激、炎癥反應和藥效維持時間短等缺點[4]，故眼科學者逐漸將注意力轉移到開發新型制劑，如前藥、凝膠、脂質體和類脂囊泡、納米膠束、納米粒和乳劑樹枝狀聚合物等[5]。

固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles， SLN)可以提高對光、濕度敏感性以及化學結構不穩定藥物的穩定性，具有靶向性、緩控釋和跨生物膜給藥等特征[6-7]，可口服給藥、注射給藥及經皮給藥等[8-9]，還可用于眼部給藥，避免對角膜細胞的損傷和滲透性差的缺點，增加藥物在給藥部位的滯留時間從而提高療效[10]。蒙脫石(montmorillonite,MMT)是具備層狀結構的硅酸鹽黏土礦，其中的硅氧四面體亞層和鋁氧八面體亞層可發生類質同象置換，具有非常高的比表面積、較大的陽離子交換容量和可膨脹性，可與外來陽離子或分子(如鹽酸倍他洛爾)進行離子交換[11-14]。

研究表明[15]，選擇性β1受體阻斷劑鹽酸倍他洛爾(betaxolol hydrochloride,BH)能抑制房水的生成，舒張血管的同時降低眼壓,也可改善視網膜和視神經乳頭血液循環[16]。

本實驗擬在前述已經獲得專利授權實驗方法[17]的基礎上進一步采用乳化蒸發-低溫固化法制備蒙脫石鹽酸倍他洛爾固體脂質納米粒(MMT-BH-SLN)，對其處方進行優化，并比較MMT-BH-SLN、BH-SLN和BH水溶液三者的體外釋放性能，開展細胞毒性的考察。

1 儀器與試藥

1.1儀器 BL-220H型1/1萬電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；Series Ⅱ Water Jacket 培養箱(廣州三元科技有限公司)；MJ-78A高壓滅菌器(上海施都凱儀器設備有限公司)；高效液相色譜儀(日本島津公司)；小圓盤磁力攪拌器(德國IKA公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇宏華儀器廠)；JY92-Ⅱ型超聲細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；96孔培養板(Nest Biotech 有限公司)。

1.2試藥 鹽酸倍他洛爾(BH，武漢遠成共創科技有限公司，批號20170510，質量分數為99.5%)；卵磷脂(上海太偉藥業有限公司)；吐溫-80，單硬脂酸甘油酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；泊洛沙姆188(德國BASF公司)；脫氧膽酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；PEG-400(天津市大茂化學試劑廠)；人永生化角膜上皮細胞(immortalized Human Cornea Epithelial Cell，iHCEC)(山東省眼科研究所)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1BH含量測定

2.1.1色譜條件 流動相：2 mL·L-1三乙胺水溶液-乙腈(7∶3，用磷酸調節pH值至3.0)；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃；檢測波長:275 nm；流速：1.0 mL·min-1。

2.1.2BH標準曲線 精密稱取BH對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，搖勻，定容，即得儲備液。分別精密量取上述儲備液0.01，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 mL，置于不同的10 mL量瓶中，定容，超聲10 min，充分混勻后，以溶劑為空白對照，按照2.1.1項下色譜條件設定HPLC參數，用0.22 μm濾膜濾過，進樣，測定峰面積。標準曲線方程為y=4 392.5x+1 055.2(r=0.998)，BH質量濃度在1～100 μg·mL-1范圍內線性關系良好，符合定量分析要求。

2.1.3精密度和回收率考察 林格氏液的配制：試液1為氯化鈉1.24 g，氯化鉀0.071 6 g，磷酸氫二鈉 0.020 6 g，碳酸氫鈉0.490 8 g和水100 mL；試液2為二水合氯化鈣0.023 g，氯化鎂 0.031 8 g，葡萄糖0.18 g，氧化型谷胱甘肽0.018 4 g和水100 mL。使用前將相同體積試液1和試液2充分混合備用。精密量取一定量的林格氏液，加入適量BH儲備液，配制成質量濃度分別為10，40和100 μg·mL-1的溶液，結果日內精密度RSD值分別為0.57%，0.14%和0.12%，日間精密度RSD值分別為0.84%，0.51%和0.18%，均小于1%，表明儀器精密度良好。精密量取1 mL空白SLN溶液,加入適量BH儲備液，配制成質量濃度分別為10，40和100 μg·mL-1的溶液，用0.22 μm濾膜濾過，按照2.1.1項下色譜條件進行測定，結果回收率分別為101.5%，100.1%和99.78%，RSD值分別為2.06%，0.30%和0.13%，符合方法學要求。

2.2酸化MMT和載藥MMT的制備

2.2.1酸化蒙脫石的制備 取一定量的原土鈉基蒙脫石(Na-MMT)和質量分數為5%的硫酸，在70 ℃水浴鍋中酸化30 min，用去離子水水洗至pH值為7，置于50 ℃的烘箱中烘干，過200目篩，即得。

2.2.2載藥MMT的制備 精密移取一定體積的BH水溶液置于燒杯中，按照MMT∶BH質量比為1∶3精密稱取酸化蒙脫石，調節其pH值至4，置于50 ℃水浴鍋中靜態吸附6 h,離心，干燥，即得。

2.3MMT-BH-SLN和普通BH-SLN的制備 精密稱取MMT-BH、BH、單硬脂酸甘油酯和卵磷脂適量，置于10 mL具塞試管中，加入無水乙醇5 mL，置于水浴鍋中(水浴溫度為75 ℃)溶解，該溶液為有機相；內水相為質量濃度為2 g·L-1的混合溶液(吐溫-80、PEG-400和脫氧膽酸鈉)15 mL。將有機相緩慢注入內水相中(有機相和內水相溫度相同，轉速為1 000 r·min-1)，持續攪拌至剩余體積為5 mL，即得初乳。將初乳快速注入并分散在0～5 ℃外水相(質量濃度為36 g·L-1的甘露醇溶液)中，繼續攪拌固化2 h，即得MMT-BH-SLN分散體。同法制備普通BH-SLN(不加MMT-BH)。

2.4平均包封率和載藥量 精密移取 MMT-BH-SLN混懸液1 mL到透析袋中，將袋口扎緊，將其放入釋放介質為10 mL水的廣口瓶中，在34 ℃轉速為120 r·min-1的恒溫振蕩器中透析，待透析平衡后吸取外相中的透析液1 mL，用0.22 μm濾膜濾過，按照2.1.1項下的色譜條件測定游離藥物的量(Wfree)；移取 MMT-BH-SLN混懸液1 mL到10 mL量瓶中并定容，離心后取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，按照2.1.1項下色譜條件測定，計算總藥物的量(Wtotal)。平行測定3次，測定包封率和載藥量。其中，Wfree：游離藥物的量；Wtotal：總藥物的量；Wlipid：納米粒的總質量。

包封率(EE)=(Wtotal-Wfree)÷Wtotal×100%

載藥量(DL)=(Wtotal-Wfree)÷Wlipid×100%

2.5MMT-BH-SLN 的制備工藝考察

2.5.1正交實驗設計及其結果 根據單因素實驗的結果，以單硬脂酸甘油酯為脂質材料，以吐溫-80、PEG-400和脫氧膽酸鈉的混合溶液為乳化劑，無水乙醇為有機溶劑。以藥物的用量(A)5～50 mg、單硬脂酸甘油酯的質量(B)10～100 mg、卵磷脂質量(C)0～150 mg、外水相體積(D)15～35 mg和內水相質量濃度(E)1～3 g·L-1為各因素的變化范圍，選擇L16(45)正交表設計進行正交實驗，見表1。

表1正交實驗設計及結果

Tab.1 Orthogonal design and results (n=3)

序號A,藥物用量/mgB,單硬脂酸甘油酯質量/mgC,卵磷脂質量/mgD,外水相體積/mLE,內水相質量濃度/g·L-1包封率/%15100151.023.93253050201.553.473550100252.055.7645100150353.037.045151050253.063.82615300352.067.6871550150151.569.04815100100201.069.3393010100351.585.60103030150251.091.011130500203.080.09123010050152.081.10135010150202.078.98145030100153.079.8015505050351.075.3016501000251.573.22K142.5563.0861.1863.47 64.91K267.4773.0068.4270.4770.28K384.4670.0572.6270.9170.88K476.7765.1269.0366.4165.19R41.919.92011.457.4425.975

以包封率為評價指標，方差分析結果見表2。通過直觀分析和方差分析得出最佳處方工藝為：A3B2C3D3E3。由表1可知，A和C為主要影響因素，其中A(藥物的用量)影響顯著(P<0.05)。影響大小順序為：E

表2方差分析結果

Tab.2 Results of variance analysis

因素離差平方和自由度FF臨界值顯著性藥物用量/mg3 983.0934.1673.290P<0.05單硬脂酸甘油酯質量/mg246.26930.2583.290P>0.05卵磷脂質量/mg276.18830.2893.290P>0.05外水相體積/mL150.01430.1573.290P>0.05內水相質量濃度/g·L-1123.32030.1293.290P>0.05誤差4 778.8815

2.5.2處方驗證 根據最優處方，精密稱取MMT-BH和BH 30 mg、單硬脂酸甘油酯 30 mg、卵磷脂100 mg，置于10 mL具塞試管中，加入無水乙醇5 mL，參照2.3項下方法制備澄清有淡藍色乳光的SLN混懸液。MMT-BH-SLN的平均包封率為81.81%±0.48%，載藥量為4.85%±0.21%。

2.6體外釋放實驗 精密量取BH溶液、BH-SLN混懸液和MMT-BH-SLN混懸液各2 mL，置于不同透析袋中，將袋口扎緊，將其放入裝有30 mL人工淚液同樣大小的廣口瓶中。將廣口瓶置于34 ℃、轉速為120 r·min-1的恒溫振蕩器中。在0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，5，6，7，8，9，10，11和12 h各取樣 5 mL,同時補充同溫同體積的人工淚液。以時間(h)為橫坐標、藥物累積釋放百分率(%)為縱坐標作圖，見圖1。

由圖1可知，BH水溶液在約2 h時累積釋放百分率幾乎達到100%，表現出較強的突釋效應；相同的時間內，BH-SLN和MMT-BH-SLN累積釋放百分率均約70%，達到穩態釋放前存在一個短時間的突釋效應，兩者持續釋放約達12 h，其累積釋放百分率分別為90%和85%；在0.5 h內BH水溶液的釋放量超過40%，而MMT-BH-SLN和BH-SLN的釋放量在40%左右，表明后兩者均體現出較弱的突釋效應而表現出明顯的緩釋性。由圖1曲線形態可知，MMT-BH-SLN比BH-SLN緩釋作用更強，能明顯降低所含藥物BH的釋放速度。

2.7細胞毒性實驗 MTT溶液的配制：將50 mg MTT粉溶解于10 mL PBS緩沖液中，濾過除菌，避光保存，2周內有效。

圖1BH水溶液、BH-SLN、MMT-BH-SLN的體外釋放曲線(n=3)

Fig.1Invitrorelease curves of BH aqueous solution，BH-SLN and MMT-BH-SLN (n=3)

將生長狀態良好的iHCEC培養、消化，隨后按照每孔細胞約1×104的量接種于96孔板中，培養16 h后除去培養液，每孔分別加入不同質量濃度的BH水溶液、空白SLN混懸液和MMT-BH-SLN混懸液各100 μL(用DMEM/F-12培養基稀釋)，作為樣品組；空白組為相同體積的DMEM/F-12培養基，培養一定時間后棄去廢液。每孔加入PBS緩沖液200 μL，清洗2次后，換新鮮培養液繼續培養20 h，隨后棄去廢液并加入含有MTT的DMEM/F-12培養基培養4 h，除去廢液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，于37 ℃恒溫下振蕩15 min，萃取出結晶的甲瓚，在酶標儀490 nm波長處測定甲瓚的吸光度值A，根據公式計算細胞存活率(cell survival rate，CSR)：CSR=A1÷A0×100%，其中，A0為空白組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值。

iHCEC存活率從大到小排列為：空白SLN>MMT-BH-SLN>BH。在低劑量下，BH水溶液中細胞存活率較高，隨著劑量的增加,存活率急劇降低，對iHCEC顯示出較大的細胞毒性；MMT-BH-SLN和空白SLN受劑量影響的變化趨勢相同，總體來看，在相同劑量下MMT-BH-SLN的細胞存活率小于空白SLN，MMT-BH-SLN相對于空白SLN毒性略有增加，可能是受到鑲嵌在蒙脫石內部的藥物BH的釋放以及附著在表面的藥物BH的影響。但相比于BH水溶液，MMT-BH-SLN對iHCEC的毒性較小，其刺激性相對較小。見圖2。

圖2BH水溶液、空白SLN、MMT-BH-SLN與iHCEC孵育2h后細胞存活率

Fig.2 Cell survival rate of BH solution，blank-SLN，and MMT-BH-SLN after 2 h incubation with iHCEC

3 討論

本研究選用BH(弱堿性化合物)為模型藥，利用特殊的載體材料MMT進行載藥，并通過正交設計優化處方制備生物相容性良好的固體脂質納米粒。包封率的測定方法有多種，如凝膠柱法、離心法、超濾法和魚精蛋白沉淀法等，透析法可以實現納米粒和游離藥物分離，游離藥物的平均回收率為98.07%，且透析法操作簡單方便，還可重復利用。

體外釋放實驗中，BH水溶液表現出一定的突釋效應。MMT-BH-SLN的藥物累積釋放百分率總體均在BH-SLN曲線下方，表明MMT-BH-SLN更能低速釋放出藥物BH，可能是由于未嵌入的游離藥物BH和黏附在固體脂質納米粒表面的藥物BH快速釋放，表現出一定的突釋效應，但隨著表面的BH釋放完，包裹在固體脂質納米粒和蒙脫石層間的BH經過離子交換后開始緩慢釋放擴散，使得MMT-BH-SLN表現出良好的緩釋效應，這能相對明顯降低包載藥物BH的釋放速度，能在較長時間內維持穩定的質量濃度，達到治療效果，減少用藥次數，大大提高患者的順應性。

長期以來，眼用制劑的安全性備受關注，現毒性研究通常使用的是整體動物或動物離體角膜。iHCEC培養模型可作為一種有效、快速的眼部用藥安全性評價的研究工具，其經過處理后可延長細胞的壽命，改善細胞生長特征，使得更接近在體環境的角膜上皮細胞[18-19]。因此，該模型對MMT-BH-SLN進行毒理學評價，可以提供細胞刺激方面的依據。本實驗后期還需建立完整的藥理、毒理和安全性評價體系，使抗青光眼納米藥物可應用于臨床。