水飛薊賓通過調控AMPK活性抑制自由脂肪酸誘導的肝細胞炎癥因子分泌

羅 頌，張 羽，何彥瑤，劉敏卓

(1.湖南省兒童醫院藥學部，長沙 410007；2.中南大學化學化工學院，長沙 410083)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由多種病因引起的以肝臟細胞內脂類物質異常積蓄為主要特征的臨床綜合征，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及相關肝硬化和肝細胞癌[1]。NAFLD與胰島素抵抗2型糖尿病、動脈粥樣硬化和高脂血癥等疾病密切相關[2]。近年來隨著人們生活水平的提高，NAFLD發病率逐年上升，發病年齡逐年下降，兒童和青少年的脂肪肝發病率逐年上升。NAFLD已成為危害人類健康最常見的慢性疾病之一[3]。研究發現，炎癥與NAFLD密切聯系，在NAFLD的患者和動物模型肝臟組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達含量增加[4-5]。肝細胞炎癥因子的分泌增加可引起肝細胞微環境炎性反應，而抗炎藥物可改善NAFLD患者的臨床癥狀[6]。

水飛薊賓是從植物水飛薊的種子和果實中提取得到的黃酮類化合物，其具有抗脂質過氧化、清除自由基、維持細胞膜穩定性和促進肝細胞再生的作用，臨床主治各種急慢性肝炎、初期肝硬化和肝中毒等疾病[7-8]。研究發現，水飛薊賓能增加高脂飲食誘導的小鼠胰島素敏感性，改善肝臟脂質代謝[9]。有研究報道，水飛薊賓可通過調節炎癥小體NLRP3的組裝而抑制炎癥因子IL-1β的釋放[10]。水飛薊賓在高脂狀況下抑制肝臟炎癥反應的作用機制尚不清楚。

腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調控細胞能量平衡的關鍵因子，AMPK的活化對非酒精性脂肪肝具有顯著作用，能調節膽固醇代謝，改善血脂異常,還可抑制巨噬細胞炎癥因子的合成[11]，水飛薊賓是否通過AMPK調節炎癥因子的釋放，目前還不清楚。本文通過自由脂肪酸誘導HepG2細胞炎癥模型研究水飛薊賓對炎癥因子分泌減少的機制，為水飛薊賓防治肝臟疾病提供了實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 生物安全柜(美國Nuaire公司)；二氧化碳培養箱(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)；酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；SDS-PAGE凝膠Western Blot儀(美國Bio-Rad公司)；實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.2試藥 水飛薊賓(質量分數≥98%)、油酸(均為阿拉丁試劑有限公司)；棕櫚酸、油紅O染色試劑(美國Sigma公司)；TNF-α試劑盒，IL-1β試劑盒，Elisa試劑盒，AMPK抗體，β-actin抗體(博士德生物公司)；p-AMPK抗體(美國CST公司)；RIPA裂解液，BCA法蛋白定量試劑盒(碧云天生物公司)；HepG2細胞(中科院上海細胞庫)；DMEM高糖培養基(Hyclone公司)；小牛血清(Gibco公司)；逆轉錄試劑盒，Real-time PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)。

2 方法

2.1HepG2細胞的培養 HepG2細胞用含有體積分數為10%的胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、質量濃度為100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI-1640培養液于37 ℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。當細胞密度生長至80%融合度時，用質量濃度為2.5 g·L-1的胰酶消化傳代。

2.2水飛薊賓對FFA誘導炎癥因子生成的影響 將HepG2細胞密度調整為2.5×104個·mL-1，接種于24孔板。待細胞生長至合適密度，將細胞隨機分為對照組、FFA處理組(500 μmol·L-1，油酸∶棕櫚酸=2∶1)以及水飛薊賓組(水飛薊賓預孵育4 h后，加入500 μmol·L-1的FFA)。

2.3水飛薊賓對HepG2細胞活力的影響 將HepG2細胞接種于96孔板，設置6個復孔。待細胞密度生長至60%時，用不同濃度的水飛薊賓(0，5，10，20，40，80和160 μmol·L-1)處理24 h，換液后加入20 μL MTT溶液，培養2～4 h后，棄上清液。每孔加入200 μL的DMSO，待藍色結晶溶解后，在酶標儀490 nm波長處檢測吸光度值A，計算細胞的相對活性，實驗重復3次。

2.4Elisa試劑盒法檢測上清液中炎癥因子的水平 用24孔板培養HepG2細胞，按照實驗設計處理各組細胞后，收集每組細胞的上清液，按照Elisa試劑盒說明書檢測細胞上清液中TNF-α和IL-1β的水平。

2.5基因表達分析 按照Trizol法提取細胞總RNA，測定總濃度后，將不同樣品的RNA反轉錄為cDNA，用于Real-time PCR擴增。TNF-α和IL-1β的引物序列為：TNF-α：5′-AGCTGGTGGTGCCATCAGAGG-3′(上游)，5′-TGGTAGGAGACGGCGATGCG-3′(下游)。IL-1β：5′-TGGCAATGAGGATGACTTGT-3′(上游)，5′-TGGTGGTCGGAGATTCGTA-3′(下游)，β-actin：5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′(上游)，5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(下游)。反應條件為：95 ℃預變性30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共45個循環，4 ℃終止反應。β-actin作為內參，用2-△△Ct法分析目的基因的相對表達量。

2.6Western Blot 收集細胞后加入適量PIPA裂解液(含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)進行總蛋白提取，采用BCA法測定蛋白濃度。用質量濃度為100 g·L-1的SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉膜將蛋白條帶移至PVDF膜上(250 mL，100 min)，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗AMPK和p-AMPK抗體4 ℃孵育過夜。洗滌后孵二抗1 h，增強化學發光ECL(enhanced chemilumin escence)底物化學發光顯色后曝光，采圖。Amersham Image 600圖像分析系統進行條帶灰度值分析，以β-actin為內參。

2.7油紅O染色 細胞處理完畢后，用PBS緩沖液沖洗3次，用質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定細胞30 min。用體積分數為60%的異丙醇洗后晾干。加入適量體積分數為0.3%的油紅O 溶液染色3 min。棄去油紅O溶液，用體積分數為60%的異丙醇洗滌3次，顯微鏡下觀察并拍照。定量分析時加入異丙醇將油紅O溶解，在510 nm處測定吸光度值A。

3 結果

3.1水飛薊賓對HepG2細胞活力的影響 MTT法檢測不同濃度水飛薊賓對HepG2細胞活力的影響，結果顯示，與空白對照組比較，5，10，20，40，80和160 μmol·L-1的水飛薊賓處理細胞24 h對細胞的活力無影響。見圖1。

3.2水飛薊賓降低FFA誘導炎癥因子的表達 FFA可誘導肝細胞炎癥因子分泌的增加，結果顯示，500 μmol·L-1的FFA可增加HepG2細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白的表達。用80和160 μmol·L-1的水飛薊賓預孵育細胞4 h后，FFA處理24 h，則降低IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白的表達，見圖2。

3.3水飛薊賓降低肝細胞內脂質的生成 HepG2細胞在FFA處理24 h后，會導致肝細胞內脂質生成。用油紅O染色法觀察細胞內脂質積累的情況，結果顯示，FFA組能明顯增加細胞內脂質生成，而水飛薊賓80和160 μmol·L-1能降低細胞中脂質的生成。見圖3。

圖1不同濃度水飛薊賓對HepG2細胞活力的影響

Fig.1 Effect of different concentration silybin on the viability of HepG2 cells

圖2水飛薊賓對FFA誘導HepG2細胞炎癥因子表達的影響

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01，與FFA組比較#P<0.05。

Fig.2 Effect of silybin on the expression of inflammatory factor of HepG2 cells induced by FFA

Note：*P<0.05，**P<0.01 vs control group，#P<0.05 vs FFA group.

圖3水飛薊賓對FFA誘導HepG2細胞脂質生成的影響

注：與對照組比較***P<0.001，與FFA組比較##P<0.01。

Fig.3 Effect of silybin on the lipid accumulation in FFA-induced HepG2 cells

Note：***P<0.001 vs control group，##P<0.01 vs FFA group.

3.4水飛薊賓通過AMPK調控HepG2炎癥因子的生成 為了探討水飛薊賓是否通過AMPK調控炎癥因子的生成，用免疫印跡法檢測AMPK的變化。結果顯示，FFA對HepG2細胞中AMPK的表達無顯著影響，但能顯著降低AMPK的磷酸化水平。水飛薊賓(80 和160 μmol·L-1)可增加p-AMPK的表達。用AMPK抑制劑(compound C)或水飛薊賓(80 μmol·L-1)預孵育HepG2細胞，用FFA處理，結果顯示，AMPK抑制劑可阻止水飛薊賓對炎癥因子的生成。見圖4。

圖4Silybin通過AMPK調節HepG2炎癥因子的生成

注：與對照組比較*P<0.05；與FFA組比較#P<0.05。

Fig.4 Silybin regulating inflammatory factors through AMPK in HepG2 cells

Note：*P<0.05 vs control group，#P<0.05 vs FFA group.

4 討論

隨著全球城市化進程的加快和生活方式的改變，NAFLD的發病率日益增長，已成為危害人類健康的重要疾病之一[3]。目前，在NAFLD的發病機制中，“二次打擊”學說被普遍接受。第一次打擊是指胰島素引起的脂肪變性，在此基礎上炎癥因子、游離脂肪酸和氧化應激等因素第二次打擊肝細胞，產生毒性，導致肝臟病理性變化[12]。由于炎癥因子在胰島素抵抗中發揮了重要作用，因此，炎癥反應貫穿于NAFLD的發生和發展過程中[13]。水飛薊賓具有保肝、護肝的作用，可通過清除體內活性氧、抗脂質過氧化和抑制一氧化氮的產生來保護肝細胞受損[14]。研究結果顯示，80和160 μmol·L-1的水飛薊賓可抑制FFA誘導的炎癥因子的產生。

在NAFLD和胰島素抵抗時，循環系統FFA濃度升高，過量的自由脂肪酸發生異位存儲，產生脂毒性[15]。FFA可引起線粒體功能障礙，引起氧化應激和活性氧增加，進而激活NF-κB信號通路[16-17]。結果表明，FFA能誘導肝細胞產生炎癥因子IL-1β和TNF-α。AMPK在肝臟脂質穩態調節中發揮重要作用，活化的AMPK可通過調節與脂肪代謝相關的靶蛋白活性從而影響肝臟脂質代謝。研究發現，AMPK可通過調節NF-κB活性抑制肝臟炎癥反應，減輕肝損傷，說明AMPK參與了NAFLD的病理過程，其可能是防治NAFLD的靶點。實驗發現，水飛薊賓逆轉FFA誘導HepG2細胞AMPK磷酸化的降低，對AMPK的蛋白量沒有影響。進一步研究發現，AMPK抑制劑compound C能阻止水飛薊賓對炎癥因子的抑制作用。這些研究均表明，水飛薊賓是通過AMPK來發揮作用的。

綜上所述，實驗發現水飛薊賓可通過AMPK抑制肝細胞炎癥因子的產生，本研究對于闡述水飛薊賓防治NAFLD的機制具有重要意義。