芫花素對流產大鼠出血量、激素水平及子宮內膜修復的影響

樊江波，張格林

(1.西安交通大學第二附屬醫院婦產科，西安 710004；2.西安交通大學第二附屬醫院骨科，西安 710004)

芫花素為益母草中的活性物質。益母草為傳統中藥，主治痛經、閉經、產后出血、月經不調、產后子宮恢復不良、產后惡露不盡及赤白帶下等癥[1]。

Fan J B等[2]用SD大鼠子宮平滑肌CMC-online-HPLC/MS方法篩選出益母草的活性成分之一為芫花素。本實驗研究芫花素對藥物流產模型大鼠子宮出血量、凝血時間、雌二醇、孕酮水平及子宮、卵巢病理形態的影響，同時研究了芫花素對藥物流產大鼠子宮復舊及子宮內膜修復相關細胞因子TNF-α和IL-1β影響的作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 UV1600比例雙光束紫外可見分光光度計(浙江福立分析儀器有限公司)；GENIUS 5K型低速離心機(長沙鑫奧儀器儀表有限公司)；680型酶標儀(日本BIO-RAD公司)；Elisa反應板(美國Waters公司)；輪轉式切片機(北京昊諾斯科技有限公司)；XSP-C204型顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)；羅氏Cobas 6000 E601電化學發光檢測儀(瑞士羅氏公司)。

1.2試藥 芫花素(質量分數>98.5%，批號BBP00737)，購自云南西麗生物技術有限公司；宮血寧膠囊(規格：0.13 g×18粒，批號ZI12005)，購自云南白藥集團股份有限公司；米非司酮片(規格：25 mg×6片，批號121201)，購自浙江仙琚制藥股份有限公司；米索前列醇(200 μg×3片，批號43110104161)，購自北京紫竹藥業有限公司；TNF-α和IL-1β血清酶免試劑盒，均購自上海科華公司；甲醛溶液(批號20111225),購自廣東光華科技股份有限公司；二甲苯(批號081023),購自四川西隴化工有限公司。

1.3動物 雄性SD大鼠30只，雌性SD大鼠70只，體質量180～220 g。均由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供。

2 方法與結果

2.1實驗動物分組及給藥 雌鼠10只作為空白對照組，其余60只雌性SD大鼠與30只雄性SD大鼠進行合籠交配，合籠比例為2∶1，觀察到成功交配后，在次日清晨取雌性SD大鼠，檢查其陰栓，并進行陰道液涂片，用顯微鏡檢查精子，鏡下查到陰栓及精子者52例，記錄為受孕第1 d。取50只受孕大鼠，均分為5組，每組10只，分別為模型組、陽性對照組、芫花素低劑量組(0.1 mg·kg-1)、芫花素中劑量組(0.2 mg·kg-1)和芫花素高劑量組(0.4 mg·kg-1)。

2.2流產模型的建立 于妊娠第7 d上午8點和下午18點，分別給予50只孕鼠灌胃米非司酮(8 mg·kg-1，0.01 mL·g-1)和米索前列醇(100 μg·kg-1，0.01 mL·g-1)制作藥物流產模型。

2.3給藥方法 給予米非司酮流產次日，全部大鼠開始灌胃給藥；空白對照組不給藥；模型組給予生理鹽水10 mL·kg-1；陽性對照組給予宮血寧10 mg·kg-1；芫花素低、中和高劑量組分別給予芫花素0.1，0.2和0.4 mg·kg-1。以上用藥，每日1次，連續7 d。

2.4檢測指標

2.4.1大鼠子宮出血量 給予大鼠米非司酮的同一天開始，在其陰道內放置40 mg無菌棉球，每日更換，連續5 d。將每日從大鼠陰道中取出的棉球收集在一起，放入密閉的試管中于0～4 ℃保存。在大鼠受孕后第14 d，從其眼眶靜脈叢中取血20 μL，用質量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉溶液2 mL溶解；將每只大鼠所收集到的棉球，用質量濃度為50 g·L-1的氫氧化鈉溶液5 mL浸泡溶解24 h，將棉球充分擠壓，使其中的血液完全浸出，將浸出液進行過濾。用分光光度計于546 nm波長處分別測定每只動物的靜脈血溶解液及棉球血溶解液A值。計算每只動物的子宮出血量。

子宮出血量(μL)=[靜脈血量(μL)×棉球血浸提A1值×浸泡棉球血氫氧化鈉體積(mL)]÷[靜脈血A2值×靜脈血稀釋用氫氧化鈉體積(mL)]

2.4.2大鼠血漿凝血酶原時間、凝血酶時間及部分凝血活酶時間 末次給藥后24 h，大鼠腹腔注射100 mL·L-1水合氯醛(0.003 5 mL·L-1)，經大鼠腹主動脈進行取血，用質量濃度為3.8 g·L-1的枸櫞酸鈉抗凝(抗凝劑∶血液=1∶9)充分離心后取血漿，用血凝分析儀測定大鼠血漿凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)以及部分凝血活酶時間(APTT)。

2.4.3血清中雌二醇和孕酮水平 經大鼠腹主動脈取血5 mL，離心取血清，用羅氏Cobas 6000 E601電化學發光檢測儀測定血清中的雌二醇(E2)和孕酮(P)的質量濃度。

2.4.4血清中TNF-α和IL-1β的含量 經腹主動脈取血5 mL，離心，取大鼠血清50 μL，測定TNF-α，取血清100 μL，測定IL-1β。

2.4.5大鼠子宮和卵巢組織形態學變化 剖腹取全例大鼠子宮及一側卵巢，將大鼠子宮及卵巢標本置于100 mL·L-1甲醛溶液中固定，24 h后將固定好的子宮及卵巢組織塊經常規的乙醇進行梯度脫水，用二甲苯進行透明，常規將子宮及卵巢組織塊石蠟包埋，制成子宮及卵巢組織蠟塊，置于4 ℃冰箱中保存待用。蠟塊用輪轉式切片機連續組織切片，切片厚度為3 μm。常規HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢和子宮的病理變化。

2.5統計分析 釆用SPSS 13.0統計分析軟件進行數據處理。以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。

3 結果

3.1對子宮出血量和凝血酶時間的影響 大鼠給藥后，陽性對照組子宮出血量較模型組減少(P<0.01)；芫花素中、高劑量組子宮出血量較模型組減少，且存在劑量依賴性。模型組大鼠PT和TT較空白對照組顯著延長(P<0.05)；陽性對照組及芫花素中、高劑量組大鼠PT及TT較模型組短。見表1。結果表明，芫花素能減少藥物流產大鼠的子宮出血量，對藥物流產后子宮出血有治療作用。藥物流產引起大鼠PT和TT延長，芫花素能縮短藥物流產大鼠的PT和TT。

表1芫花素對藥物流產大鼠子宮出血量和凝血酶時間的影響

組別劑量/mg·kg-1子宮出血量/μL PT/s TT/sAPTT/s空白對照組10.8±0.66?25.1±2.70?35.8±4.82模型組206.0±59.712.8±1.9528.5±2.3632.6±5.04陽性對照組10135.4±21.5??10.1±0.92??25.0±3.26?34.8±4.19芫花素低劑量組0.1178.5±68.711.0±1.2627.3±1.5534.5±4.76芫花素中劑量組0.2155.1±25.8?10.7±1.22?25.4±1.86?35.9±4.79芫花素高劑量組0.4133.9±13.9??10.4±0.56??24.9±2.17?36.1±4.41

注：與模型組比較，*P<0.05為差異有統計學意義，**P<0.01為差異有顯著統計學意義。

3.2對雌二醇、孕酮水平及血清中TNF-α和IL-1β的影響 模型組大鼠血清雌二醇質量濃度降低，而孕酮升高，與空白對照組比較差異有顯著統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組及芫花素中、高劑量組藥物流產大鼠血清中雌二醇質量濃度顯著升高(P<0.05)。模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量顯著升高，與空白對照組比較差異有極顯著統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組及芫花素中、高劑量組藥物流產大鼠體內TNF-α和IL-1β含量顯著降低。見表2。結果表明，芫花素可升高藥物流產大鼠體內雌二醇質量濃度和降低藥物流產大鼠體內TNF-α和IL-1β含量。

表2芫花素對流產大鼠體內雌二醇、孕酮水平及血清中TNF-α和IL-1β的影響

組別劑量/mg·kg-1雌二醇/ng·mL-1孕酮/ng·mL-1TNF-α/ng·mL-1IL-1β/ng·mL-1空白對照組151.6±34.7??12.0±4.14?? 62.15±7.28?? 4.38±0.83??模型組 95.7±8.117.9±4.79115.39±18.1712.51±1.27陽性對照組10131.1±17.9??14.1±3.72 91.56±15.93? 8.72±0.93?芫花素低劑量組0.1103.2±18.315.2±7.41107.21±18.0311.79±0.98芫花素中劑量組0.2114.6±24.3?13.6±6.78 96.85±13.43? 9.02±0.83?芫花素高劑量組0.4120.7±23.7??15.2±6.77 93.74±11.27? 8.68±0.68?

注：與模型組比較，*P<0.05為差異有統計學意義，**P<0.01為差異有顯著統計學意義。

3.3芫花素對卵巢、子宮病理形態的影響 見圖1。由圖1可知，各組動物的卵巢組織結構正常，皮髓質分界清楚，多級卵泡可見，不同發育階段黃體可見，組間比較無明顯差異。模型組子宮內膜較薄，大部分存在內膜不完整或脫落，內膜呈低柱狀或立方狀，子宮腔比正常大鼠略大，肌層與空白對照組相比較薄。陽性對照組及芫花素中、高劑量組各例子宮的漿膜、肌層、內膜結構清楚，黏膜覆單層柱狀上皮，完整無脫落。固有膜中可見單管狀子宮腺。子宮腔大小基本正常，肌層較厚，與正常大鼠基本相同。子宮內膜未見增生過長。

圖1芫花素對卵巢、子宮病理形態的影響(100×)

①空白對照組子宮；②模型組子宮；③陽性對照組子宮；④芫花素低劑量組子宮；⑤芫花素中劑量組子宮；⑥芫花素高劑量組子宮；⑦空白對照組卵巢；⑧模型組卵巢；⑨陽性對照組卵巢；芫花素低劑量組卵巢；芫花素中劑量組卵巢；芫花素高劑量組卵巢。

Fig.1 Effects of genkwanin on uterus，ovarian pathological morphology in the medical-abortion rat (100×)

①uterus of blank control group；②uterus of model group；③uterus of positive control group；④uterus of low dose genkwanin group；⑤uterus of middle dose genkwanin group；⑥uterus of high dose genkwanin group；⑦ovarian of blank control group；⑧ovarian of model group；⑨ovarian of positive control group；ovarian of low dose genkwanin group；ovarian of middle dose genkwanin group；ovarian of high dose genkwanin group.

4 討論

研究結果表明，芫花素可有效減少藥物流產大鼠的子宮出血量，縮短大鼠PT和TT，升高藥物流產大鼠體內雌二醇的質量濃度，對藥物流產后子宮出血有治療作用。可能與芫花素可促進藥物流產大鼠子宮內膜增生恢復、促進子宮平滑肌收縮、導致流產大鼠子宮腔較快時間恢復至正常大小有關。這也為產后子宮復舊不良、惡露不凈的治療提供了依據，通過進一步研究其作用機制，芫花素有望用于臨床治療產后子宮復舊不良等。

病理研究表明，模型組10例中有6例子宮內膜不完整或脫落，子宮腔比正常大鼠略大；陽性對照組子宮內膜較厚，表面被覆單層柱狀上皮，子宮腔較小，接近空白對照組；芫花素低劑量組子宮內膜為單層柱狀、低柱狀或立方狀上皮，10例中有2例內膜不完整或脫落，子宮腔略大于正常對照組；芫花素低劑量組10例中有2例內膜不完整或脫落，子宮腔略大于空白對照組；芫花素中、高劑量組子宮內膜為單層柱狀上皮，內膜結構清楚，完整無脫落，子宮腔大小正常。病理結果提示，芫花素可促進藥物流產大鼠子宮內膜增生恢復，促進子宮平滑肌收縮，恢復子宮腔正常大小。

產后子宮復舊不良的機制可能與卵巢激素、內膜修復及止血過程有關。韓秀君等[3]用益母草治療產后子宮復舊不良及惡露不凈；李春梅等[4]研究產后子宮復舊以及子宮內膜的修復機制，表明益母草對子宮蛻膜崩解、內膜修復、排出惡露及調節子宮張力作用良好。

TNF-α具有雙重作用，一方面在機體生理功能和抗感染等方面發揮免疫調節的重要作用，另一方面若TNF-α持續釋放或產生過多則呈現其毒性作用，產生的免疫反應劇烈。NF-κB可調控TNF-α的產生，而TNF-α釋放增加又促進了IκB的磷酸化，這使NF-κB進一步激活，從而延續炎癥反應的復雜環路調節，導致了最初的炎癥信號進一步放大[5-7]。子宮內膜炎的發生與NF-κB途徑的激活密切相關，研究發現，可通過抑制NF-κB信號通路達到減弱子宮內膜炎癥[8-10]，促進子宮內膜修復[11-13]。白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)又名淋巴細胞刺激因子，在機體中發揮著重要的作用，在細胞免疫的激活過程中具有調節作用[14-15]。在機體中，IL-1β參與許多生理過程，能刺激PDGF、集落刺激因子等細胞因子的產生[16-18]，在組織修復和免疫應答過程中起重要作用[19-20]。

本實驗研究了芫花素對藥物流產大鼠子宮復舊及子宮內膜修復相關細胞因子TNF-α和IL-1β含量的影響，芫花素中、高劑量組能顯著降低藥物流產大鼠體內的TNF-α和IL-1β含量(P<0.05)，提示芫花素可能參與了子宮復舊及子宮內膜修復過程，能減輕炎癥反應、促進子宮復舊及子宮內膜修復。