高脂飲食誘導建立小鼠高脂血癥模型

鮑 和，張昌龍，蘇婭萍，高 陽，張海龍 *

(1.西安交通大學第二附屬醫院藥學部，西安 710004；2.西安交通大學藥學院，西安 710061)

心腦血管疾病是人類健康的第一大殺手，而高脂血癥是動脈粥樣硬化和冠心病發病的最危險因素[1]。高脂血癥的發病機制和降脂藥物的作用機制需要深入研究，建立和選擇理想的高脂血癥動物模型是開展相關實驗、研究脂質代謝紊亂的關鍵。現已在大鼠、小鼠、豚鼠、金黃地鼠、家兔、小型豬、犬、禽類和靈長類等實驗動物上建立了高脂血癥模型[2-5]。小鼠因其價格便宜、進食量小、給藥量小、造模成本低、灌胃或采樣方便、容易操作等優點成為一種重要的高脂血癥動物模型。

高脂血癥動物模型主要有先天性、轉基因和飲食或化學物質誘導3種[6]。前2種由于價格昂貴和來源限制，不能廣泛應用，飲食或化學物質誘導應用最為廣泛，主要包括兩類，一類是利用高脂飼料喂飼或灌胃一段時間后形成的；另一類是利用化學試劑通過靜脈或腹腔注射一次性形成的。高脂飼料長期喂飼產生的高脂血癥與人類長期食用高熱量食物產生的高脂血癥十分接近，因此這種動物模型是較為理想的降脂新藥篩選的模型。

1 儀器與材料

1.1儀器 Multifuge X1R離心機(德國Heraeus公司)；渦旋混合儀，組織勻漿機(德國IKA公司)；Synergy HT酶標儀(美國Bio-Tek儀器有限公司)；精密天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2試藥 膽固醇，膽酸鈉(平頂山市慧生源生物制品有限公司)；蔗糖及阿拉伯膠(天津市褔晨化學試劑廠)；豬油(實驗室自制)；非諾貝特片(上海信誼萬象藥業股份有限公司)；三酰甘油、總膽固醇和葡萄糖試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)。

1.3動物 昆明種小鼠，體質量為18～22 g；C57BL/6小鼠，體質量為18～20 g。均為雄性，SPF級，由西安交通大學醫學部動物實驗中心提供。

2 方法

2.1高脂飼料配方(質量分數)及給藥方案 高脂飼料1：蔗糖(10%)、豬油(15%)、膽固醇(2%)、膽酸鈉(0.2%)和基礎飼料(72.8%)[6]；高脂飼料2：蔗糖(10%)、豬油(15%)和基礎飼料(75%)；高脂飼料3：蔗糖(50%)、豬油(20%)和基礎飼料(30%)；高脂飼料4：蔗糖(10%)、豬油(45%)和基礎飼料(45%)。先將蔗糖用適量溫水溶解，再用此溫熱的蔗糖水溶液將豬油溶解，與基礎飼料和其他成分充分攪拌混勻后制成直徑為3 cm的圓柱，烘干備用。用4種飼料分別喂飼小鼠2～8周，每天記錄體質量和進食量。

2.2實驗及分組 實驗一：30只雄性昆明種小鼠，體質量為18～22 g，隨機分成3組，每組10只，正常組喂飼普通飼料,對照組喂飼高脂飼料1，陽性對照組喂飼高脂飼料1和非諾貝特。喂飼4周后，每日灌胃，給予正常組小鼠蒸餾水，對照組50 g·L-1的阿拉伯膠溶液，陽性對照組給予非諾貝特(100 mg·kg-1)，連續4周，每日稱定體質量，計算進食量。在第8周結束時，乙醚麻醉狀態下眼眶取血，離心，測血漿總膽固醇和三酰甘油的水平；解剖小鼠，取附睪、副腎、腸系膜處脂肪和肝臟，分別稱定質量，計算肝臟指數=(肝質量÷體質量)×100%。精密稱取100 mg肝臟，加入3 mL蒸餾水，勻漿后測定其中三酰甘油和總膽固醇的含量。

實驗二：20只雄性昆明種小鼠，體質量為18～22 g，隨機分成2組，每組10只。正常組喂飼高脂飼料1，模型組喂飼高脂飼料2，4周后，按照實驗一項下方法測定血漿及肝臟中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察膽固醇和膽酸鈉的有無對血脂和肝臟中脂肪含量的影響。

實驗三：20只雄性C57BL/6小鼠，體質量為18～20 g，隨機分成2組，每組10只。正常組喂飼普通飼料，模型組喂飼高脂飼料1，4周后，按照實驗一項下方法測定血漿中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察同一種高脂飼料對不同種系小鼠高脂血癥成模的區別。

實驗四：20只雄性C57BL/6小鼠，體質量為18～20 g，隨機分成2組，每組10只。正常組喂飼普通飼料，模型組喂飼高脂飼料1，4周后，模型組中的小鼠恢復普通飼料喂飼1周，按照實驗一項下方法測定血漿中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察已成高脂血癥模型的持久性，即高脂血癥小鼠在恢復普通飼料喂飼后總膽固醇和三酰甘油水平是否可逆。

(3)為與國際礦產資源資產評估規范接軌，SME成立了SME評估標準委員會，積極參與國際評估規范的商討。

實驗五：30只雄性C57BL/6小鼠，體質量為18～20 g，隨機分成3組，每組10只。正常組喂飼普通飼料，模型1組喂飼高脂飼料3，模型2組喂飼高脂飼料4，4周后，按照實驗一項下方法測定血漿中三酰甘油和總膽固醇的水平，考察以高糖為主的高脂飼料3和豬油為主的高脂飼料4對高脂血癥成模的影響。

2.3血清脂質的測定 動物禁食12 h后，用乙醚麻醉，眼眶取血，以12 000 r·min-1離心5 min，及時分離出血清，按照試劑盒方法測定血清中的三酰甘油、總膽固醇或血糖水平。

2.4肝臟組織勻漿及脂質的測定 精密稱取小鼠肝臟組織100.0 mg，置于裝有3 mL蒸餾水的離心管中，用組織勻漿機充分勻漿后，按照試劑盒方法測定肝組織勻漿液中三酰甘油和總膽固醇的水平。

3 實驗結果

3.1高脂飼料1對昆明種小鼠體質量、進食量、血脂及內臟脂肪含量的影響 見圖1。由圖1可知，實驗結果各組間差異無統計學意義，與正常組比較，高脂飼料并沒有使小鼠的體質量明顯增加，相反，模型組小鼠的體質量一直比正常組小鼠體質量增加的少。陽性對照組的情況與模型組類似。這可能是由于該高脂飼料口感和味道不好，使小鼠進食量減少所致，從第1周后，模型組和陽性對照組小鼠的進食量明顯比正常組減少(P<0.01)，前3周模型組和陽性對照組小鼠的進食量在逐漸降低，從第4周開始又逐漸增多，但整個實驗期間喂飼高脂飼料的小鼠的進食量均比正常組少，見圖2。

圖1高脂飼料1對昆明種小鼠體質量的影響

圖2高脂飼料1對昆明種小鼠進食量的影響

注：與正常組比較*P<0.01。

Note：*P<0.01 vs normal group.

高脂飼料1對昆明種小鼠血脂和血糖的影響見表1。由表1可知，長期喂飼高脂飼料1能使模型組中的昆明種小鼠的血漿總膽固醇值顯著升高(1 892±83 mg·L-1vs 691±32 mg·L-1，P<0.01)，成功建立了小鼠高膽固醇血癥模型。但這種高脂飼料不但沒能升高模型組中昆明種小鼠的血漿三酰甘油水平，反而大大降低了其水平，降低幅度達到54.6% (1 125±116 mg·L-1vs 2 061±138 mg·L-1，P<0.01)，這表明該高脂飲食能夠抑制小鼠體內三酰甘油的合成，給予非諾貝特的陽性對照組小鼠血漿中三酰甘油值更低，這說明除了該高脂飲食抑制了小鼠血漿三酰甘油的合成外，非諾貝特還進一步降低了血漿三酰甘油水平。

同時，高脂飲食對血糖的影響不大(822±51 mg·L-1vs 982±63 mg·L-1)，但給予非諾貝特的陽性對照組小鼠血糖值與模型組比較有輕度升高，這是該藥的不良反應引起的。

高脂飼料1對昆明種小鼠肝臟脂肪的影響：與正常組比較，模型組小鼠肝臟總膽固醇和三酰甘油的水平均升高(總膽固醇:667±75 mg·L-1vs 141±7 mg·L-1，三酰甘油:1 524±139 mg·L-1vs 533±51 mg·L-1，P<0.01)，而給予非諾貝特的陽性對照組小鼠肝臟總膽固醇和三酰甘油水平與模型組比較顯著降低(總膽固醇:332±36 mg·L-1vs 667±75 mg·L-1，三酰甘油：969±58 mg·L-1vs 1 524±139 mg·L-1，P<0.01)，但仍沒有恢復到正常組小鼠的水平。這說明此種高脂飼料能夠引起肝臟脂肪升高，同時非諾貝特發揮了降脂作用，改善了脂肪肝的程度。

表1高脂飼料1對昆明種小鼠血脂和血糖的影響

項目正常組/mg·L-1模型組/mg·L-1陽性對照組/mg·L-1血漿三酰甘油2 061±1381 125±116?661±55?#血漿總膽固醇691±321 892±83?965±56?#血漿葡萄糖982±63822±511 147±32#

注：與正常組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01。

高脂飼料1對昆明種小鼠內臟脂肪和肝質量的影響見表2。由表2可知，該高脂飼料未顯著增加昆明種小鼠的內臟脂肪含量，也未增加肝質量。但值得指出的是，非諾貝特明顯增加了小鼠的肝質量，這是該藥的一個明確的不良反應。

表2高脂飼料1對昆明種小鼠內臟脂肪和肝質量的影響

組別體質量/g脂肪質量/g附睪副腎腸系膜內臟脂肪總質量/g肝質量/g肝臟指數/%正常組35.0±0.50.54±0.040.21±0.020.71±0.031.46±0.071.92±0.065.50±0.13模型組31.0±3.20.47±0.060.23±0.030.59±0.071.28±0.051.79±0.205.41±0.57陽性對照組35.0±0.60.52±0.030.24±0.020.60±0.021.36±0.073.29±0.15?#9.37±0.32?#

注：與正常組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.01。

盡管該種配方的高脂飼料沒有明顯改變昆明種小鼠的體質量和內臟脂肪含量，卻明顯增加了肝臟的脂質含量，模型組小鼠肝臟與正常組小鼠相比明顯呈現灰白色，這是脂肪肝的標志。

3.2膽固醇和膽酸鈉對昆明種小鼠血脂和肝臟脂肪的影響 實驗表明，高脂飼料1使昆明種小鼠的血漿三酰甘油值不升反降，考察配方中加入和不加入膽固醇和膽酸鈉對小鼠血漿和肝臟脂肪的影響。實驗結果表明，膽固醇和膽酸鈉對小鼠肝臟總膽固醇和三酰甘油含量影響均較大，喂飼加入膽固醇和膽酸鈉的高脂飼料1的小鼠比喂飼不加入膽固醇和膽酸鈉的高脂飼料2的小鼠肝臟總膽固醇值高5.9倍 (1 073±394 mg·L-1vs 182±7 mg·L-1，P<0.01)，三酰甘油值高1.6倍 (2 834±253 mg·L-1vs 1 751±301 mg·L-1，P<0.01)；同時，膽固醇和膽酸鈉的有無對小鼠血漿總膽固醇值影響不大(1 495±74 mg·L-1vs 1 613±69 mg·L-1)，與血漿三酰甘油值呈負相關，即飼料中含有膽固醇和膽酸鈉能使小鼠血漿三酰甘油值顯著降低(610±32 mg·L-1vs 2 273±145 mg·L-1，P<0.01)。

3.3小鼠種系對高脂血癥成模的影響 考察另一種C57BL/6小鼠，結果表明，C57BL/6小鼠的情況與昆明種小鼠類似，高脂飼料1能使C57BL/6小鼠血漿總膽固醇值顯著升高(987±48 mg·L-1vs 495±18 mg·L-1，P<0.01)，卻同樣使血漿三酰甘油值不升反降(697±50 mg·L-1vs 1 141±97 mg·L-1，P<0.01)。說明這2個種系的小鼠均無法使用該種高脂飼料成功升高血漿三酰甘油水平。

3.4高脂飲食誘導C57BL/6小鼠高脂模型的恢復(7 d) C57BL/6小鼠用高脂飼料1連續喂飼4周后，恢復正常飲食1周，結果血漿總膽固醇值下降較快，恢復接近正常小鼠水平(644±24 mg·L-1vs 543±10 mg·L-1，P<0.01)。同時，血漿三酰甘油值也不再受到抑制，恢復到正常小鼠水平(1 103±127 mg·L-1vs 1 043±21 mg·L-1)。說明通過高脂飲食喂飼建立高脂血癥模型后，高血脂狀態可以恢復。

3.5以高糖和高脂為主的飼料對C57BL/6小鼠高脂血癥的影響 見表3。由表3可知，以高糖為主的飼料同樣能使血漿總膽固醇升高，并降低血漿三酰甘油的水平，增加飼料中豬油的含量至45%也得到了類似的結果。另外，此2種配方的飼料對小鼠血糖無明顯影響，說明不同配方的高脂飼料(增加脂肪的含量或以高糖為主)對高脂血癥成模的影響不大。

表3高脂飼料3和4對C57BL/6小鼠總膽固醇和三酰甘油的影響

項目正常組高脂飼料3高脂飼料4血漿總膽固醇438±5694±37??893±65??血漿三酰甘油1 089±49550±37??948±61?血漿葡萄糖897±53915±51902±36

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

小鼠是一種重要的高脂血癥動物模型，盡管小鼠內源性膽固醇的合成量和血漿清除率高于人類很多倍，且小鼠血漿中不含CETP，與人類差異較大[7]，但小鼠模型給藥量小，這對于含量較低、制備困難的天然產物的降脂活性研究來說具有獨特的優勢。而橄欖油灌胃或75%蛋黃乳劑腹腔注射造成的急性高脂血癥動物模型，與人類長期食用高脂高熱量飲食所形成的高脂血癥有較大差異；高脂飼料長期喂飼產生的高脂血癥持續時間相對較長，與人類的高脂血癥形成過程類似，是一種較好的造模方法。

實驗結果表明，采用高脂飼料1喂飼8周后血漿總膽固醇水平顯著增加，還增加了肝臟中總膽固醇和三酰甘油的含量，降低了血漿三酰甘油的水平。由于高脂飼料含有較多豬油，飼料性質發生改變，口味較重，小鼠進食量減少，這可能是造成其體質量與正常組比較沒有明顯增加的原因。小鼠內源性膽固醇的合成量和血漿清除率遠高于人類，從而減少肝臟合成膽固醇，增加膽汁酸的生成和排泄，抑制血脂的升高[8]。另外，小鼠機體缺乏膽固醇轉運蛋白，血清中70%的總膽固醇都以HDL-C的形式存在，也不易形成動脈硬化[9]。實驗結果顯示，高脂飼料1能夠建立昆明種小鼠的高膽固醇血癥和脂肪肝，卻不能建立高三酰甘油血癥模型，這可能由于外源性膽固醇的大量攝入抑制了小鼠內源性三酰甘油合成，或同時抑制了三酰甘油從肝臟向血液的釋放。同時小鼠體內存在一種抑制血漿三酰甘油升高的機制，因為含較高比例豬油而不含膽固醇和膽酸鈉的高脂飼料也未能造成小鼠血漿三酰甘油的升高。這一結果與灌胃高脂乳劑不能建立小鼠高三酰甘油血癥類似[10]。

影響高脂血癥成模的因素有動物種系、性別、年齡、高脂飼料配方和喂飼方式等。一般來說，雄性比雌性更易成模，穩定[11]，因此本研究中均采用雄性小鼠。本實驗中采用昆明種小鼠和C57BL/6小鼠2種，結果表明二者之間并無顯著性差異。高脂飼料主要由基礎飼料、膽固醇和豬油等按照一定比例配制而成，有時可用蛋黃粉代替膽固醇。其中，豬油和膽固醇是必不可少的[12]，二者在飼料中含量的變化將會影響造模效果。一般是豬油和膽固醇含量越高，造模效果越好。為增強造模效果，還可加入能促進膽固醇吸收的膽酸鹽或抑制甲狀腺功能的甲基/丙基硫氧嘧啶等物質。但抗甲狀腺素分泌類藥物易造成模型動物肝臟及淋巴結損傷，增加模型動物死亡率，不符合正常血脂代謝過程，建議少用或不用[8]。張智等[13]對比了含膽鹽和不含膽鹽的2種高脂飼料對大鼠造模效果的影響，發現含膽鹽的高脂飼料明顯優于不含膽鹽的高脂飼料，因為膽鹽能促進膽固醇與脂肪的吸收，使動物迅速形成高脂血癥。研究結果表明，高脂飼料中膽固醇和膽酸鈉的有無對肝臟中膽固醇和三酰甘油的含量有重要影響，且呈正相關，但對血漿膽固醇水平的影響不大，同時與血漿三酰甘油的水平呈負相關，即膽固醇和膽酸鈉的存在會極大地降低血漿三酰甘油的水平。因此，要造成單純的小鼠高膽固醇血癥，高脂飼料中添加膽固醇和膽酸鈉并不是必須的，與前人在大鼠上的實驗結果明顯不同[13]。

長期灌胃高脂乳劑能形成高脂血癥，盡管該方法在保證個體間高脂乳劑攝入量的統一方面彌補了飼喂法造成的模型動物之間指標的均一性較差的不足，但此方法使動物處于長期應激狀態，影響結果的準確性[2]。因此采用高脂飼料喂飼法讓動物自由攝食更接近人類患高脂血癥的過程，取得的結果也更準確。實驗結果顯示，利用近交系的C57BL/6小鼠個體間差異很小，且造成小鼠高膽固醇血癥后恢復正常飲食1周，高膽固醇血癥雖有降低，但與正常組比較依然偏高。同時，低三酰甘油血癥有所恢復，說明實驗中所采用的高脂飲食對小鼠血漿中三酰甘油有抑制作用。

實驗結果表明，使用高糖為主的飼料喂飼C57BL/6小鼠4周并不能造成小鼠內源性高三酰甘油血癥，與高脂飼料1相同，極大地抑制了血漿中三酰甘油的水平(550±37 mg·L-1vs 1 089±49 mg·L-1，P<0.01)；同時，該配方高脂飼料升高血漿膽固醇的幅度也不大(約1.6倍)，因此以高糖為主的高脂飼料并不適合造成小鼠高脂血癥模型。這與加糖的脂肪乳長期灌胃也不能形成高三酰甘油血癥的結果一致[14]。

研究表明，采用含有一定比例豬油的高脂飼料長期喂飼能夠成功建立小鼠高膽固醇血癥模型，但不能建立高三酰甘油血癥模型，如想同時建立小鼠高膽固醇血癥和脂肪肝模型，高脂飼料中添加膽固醇和膽酸鈉是必須的。因此，要篩選主要降低膽固醇的天然產物可選擇小鼠高膽固醇血癥模型。

研究表明，用以豬油或高糖為主要配方的高脂飲食無法成功誘導昆明種小鼠或C57BL/6小鼠成為高三酰甘油血癥模型。