MALDI-TOF MS技術及其在食品微生物檢測方面的應用

顧春華

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000）

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術是近年來發展起來的一種非常矚目的軟電離技術方法，該技術使傳統的主要用于小分子物質研究的質譜技術發生了革命性的變革，其不但適用于蛋白質、多肽等生物大分子的高通量篩選，還可以對寡核苷酸、基因的單核苷酸多態性、微生物鑒定分型等進行分析，其優點是：（1）軟電離，不會把分子打碎；（2）檢測范圍寬，最大可達400 kDa；（3）可以檢測混合物；（4）對鹽/污染物容忍性好[1]，因此，在蛋白質組學[2]、基因研究[3]、臨床醫學[4-5]等領域得到了廣泛應用。尤其對于臨床微生物的鑒定，MALDI-TOF MS技術可快速鑒定以前難以培養的厭氧菌（分枝桿菌（Mycobacterium）、真菌等）至種、亞種水平，操作簡單、速度快、成本低，且數據庫可不斷完善[6-7]。

目前，食品微生物的鑒定技術主要包括建立在形態學、細胞生理學、生物化學水平上的經典生理生化方法，以及逐步成熟的分子生物學方法。其中，經典生化方法雖具有權威性，但操作繁瑣，檢測周期長。分子生物學方法雖然將鑒定水平提升至核酸分子，但僅能鑒定至屬，對種和亞種尚不能有效鑒定，而且要通過細菌脫氧核酸（deoxyri bonucleic acid，DNA）提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、瓊脂糖凝膠電泳、序列測定與比對等復雜過程[8-9]。而MALDI-TOF MS技術雖然相比較上述方法有了質的飛躍，發展勢頭也很迅猛，但在食品微生物檢測領域的應用上[7]，還是有一定的局限性，不如臨床微生物普及率大。本文將從食品微生物的培養條件、MALDITOF MS設備、數據庫、方法標準的局限性等方面對這一現象進行闡述。

1 MALDI-TOF MS技術原理和關鍵因素

MALDI-TOFMS技術是基質輔助激光解吸電離（MALDI）技術與飛行時間質譜（TOF MS）的結合[10-11]。基質輔助激光解吸電離（MALDI）技術于1987年由HILLENKAMP F及KARASM首次提出[12]。其原理是將待測物混入基質中并被基質包圍，通過激光轟擊待測樣品與基質形成的共結晶薄膜，由于基質濃度遠高于待測物濃度，基質分子吸收大部分激光能量，瞬間由固態轉變成氣態，形成基質離子，在待測物與激發出的基質離子的碰撞中，發生了待測物的離子化，在這個過程中，并不會導致高分子發生鏈斷裂，通常只生成分子離子及分子離子的多聚體[13]。飛行時間質譜（TOF MS）在20世紀40年代中期首先由STEPHENS W E提出[15]。其原理是在加速電壓和飛行距離一定的情況下，被電離的待測物質的質子數與電荷數的比值（m/z）與飛行時間的平方成正比。電離的生物分子在電場作用下加速通過飛行管道，根據到達檢測器的時間及離子的數量，得到了橫軸為m/z、縱軸為峰強度值的圖譜，從而被質量分析器檢測[15]。

在MALDI-TOF MS技術中，靶板上的基質對最終的檢測結果起著重要作用，它的主要功能是吸收脈沖激光的能量，另外要使基質能夠很好地分散樣品分子，防止其聚集，提高電離效率，并且還不能破壞待測分子。首先要求基質對激光光源有很強的吸收，因此大多數基質化合物均為含苯環的有機化合物；第二要求基質與被測分子具有很好地相容性，同時不能有分子間的相互作用，所以得到一個合適的基質并不容易[16-17]。目前，根據待測物和實驗目的的不同，通常選用的基質有2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）和芥子酸（sinapic acid，SA）等，在這些基質中添加一些合適的添加物，形成共基質在實踐中也是常見的。如將0.1%的甲酸加入基質溶液，可以部分抑制來自培養基的鹽污染，提升實驗效果。一般情況下，DHB用于寡糖、糖肽和糖蛋白的研究，它適用于小分子質量組分，而CHCA一般用于蛋白質的研究[18]。同一物種質譜圖譜的不同，有時取決于所使用的基質，而基質的選擇則取決于對待測物的研究。

合成高分子的離子化在一般情況下是金屬離子陽離子化，很難通過加質子使其離子化，往往需要加堿金屬鹽類或銀銅等金屬鹽類形成離子絡合物達到離子化目的。對于含胺官能團的化合物（如蛋白質、多肽），可與基質提供的氫離子直接質子化，不需直接加金屬離子[19]。

微生物有其自身獨特的蛋白質組成，可以將由MALDITOF MS獲得的菌種圖譜與數據庫中的參考譜圖做對比，通過觀察特異峰的位置和強度，然后根據同源性距離得到最接近的菌種并給出相應的鑒定分值。鑒定分值代表待測物與數據庫的參考菌株比對后的可信水平，最終可得到鑒定結果。而且MALDI的電離方式為軟電離，可使整個蛋白分子在離子化過程中都能夠保持完整，得出的質譜圖會讓不同大小的分子有序排布，這樣就便于對譜圖進行分析。通常，鑒定分值在1.99～2.30之間為滿足種鑒定，1.70～1.98之間為滿足屬鑒定、種可接受，分值在1.70以下為不可信，需要重新鑒定、查找原因或選用其他方法。菌種培養后的鑒定方法十分簡單，一種為取少量菌落直接點靶，加1μL基質（CHCA溶于10%三氟乙酸與70%乙腈制成的過飽和溶液）充分混勻，干燥后上機；另一種將少量菌落溶解于蛋白提取液（10%三氟乙酸與70%乙腈等量混勻）10 μL中，充分研磨裂解，1 μL裂解液點靶，再加1 μL基質，干燥后上機。

2 MALDI-TOF MS技術檢測的局限性

2.1 培養條件和樣品處理方式

MALDI-TOF MS技術目前仍依賴于培養，需要培養后的純菌株用于鑒定[20]。其鑒定依據包括（1）不同微生物的光譜指紋圖譜不同；（2）在光譜中，被檢測到的蛋白質的峰（分子質量）對某些屬、種，甚至亞種是特異的；（3）在相同的培養條件下所獲得的微生物譜圖是可重復的。有時，同種的微生物得到了不同的質譜圖，是由于其生長條件的不同或不同的化學提取方法導致的。因此，選擇最合適的培養條件和控制標準化的樣品制備方法是獲得可重復質譜圖的必要條件，在建立標準化方案時必須考慮，也就是基質、培養基、溫度、濕度及培養時間的不同均會影響微生物蛋白的表達，使圖譜發生變化[21]。CONWAY G C等[22]研究了培養基種類和培養時間對大腸桿菌（Escherichia coli）的影響，結果表明培養基的種類和培養時間均能影響菌種特異峰的出現，導致譜圖發生變化；HORNEFFER V等[23]在鑒定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）時，研究發現不同類型的培養基對蛋白圖譜有影響。但也有研究表明，雖然培養基、培養基溫度及培養時間的不同均會導致菌種蛋白質圖譜發生變化，但對最終鑒定結果影響較小，鑒定結果仍然是可信的[24-26]。DIECKMANN R等[27]研究發現，采用基礎培養基和選擇性培養基得到的細菌蛋白圖譜，其特異峰基本一致；MADIGAN M T等[28]進一步研究了生長在固體瓊脂培養基和肉湯培養基的菌種產生蛋白圖譜差異的原因，發現可能是固體瓊脂上的菌落，中間的細胞相對于周邊的細胞年齡要大一些，而生長在肉湯中的培養物，它們的生長基本是同步的。因此，只要將實驗條件控制好，技術的重現性還是不錯的[29]。DIECKMANN R等[27]檢驗了CHCA、DHB、SA三種不同基質對沙門菌屬（Salmonella）的不同種及亞種的MALDI-TOF MS分析效果，結果表明，芥子酸（SA）對沙門菌屬的鑒定結果更好，SA更易與分析樣品混合均勻，使樣品靶上的各個位置解吸效果相似。另外，干燥后樣品靶點的厚度和稠度等因素都會對譜圖質量產生一定的影響。

2.2 檢測設備

MALDI-TOF MS技術發展至今雖然有很多的優點，但還存在儀器本身的全譜靈敏度、分辨率和質譜、光譜重現性不佳，靈敏度、可靠性較差等缺點[30]，因此人們普遍認為MALDI-TOF MS不是定量的分析手段，在食品微生物檢測應用中的進一步推廣也受到影響。要從應用角度解決MALDI-TOF MS定量分析，可以從樣品前處理、點樣方式和儀器本身的定量分析誤差等幾個方面著手。首先，樣本與基質分子形式的結晶層在MALDI靶板上的分布是不均的，而且此類儀器采用的氮氣激光器的發射頻率通常被限制在50 Hz左右，所以通常在單位時間內僅有一小部分（通常＜1%）樣品分子被激光照射電離和分析，使每個疊加后的質譜圖中離子強度重現性非常不穩定，誤差會高達30%以上。其次，MALDI-TOF MS設計中無法對不同大小離子在初始空間及速度上同時完成聚焦，加上通常MALDI-TOF激光照射入射角度的不對稱性，使得傳統MALDI-TOF MS儀器設計中有造成質量偏倚性的許多因素，在不同質量區間的分辨率、靈敏度有較大的區別。

2.3 數據庫

數據庫是MALDI-TOF MS的核心，待檢測微生物只有在數據庫里有相應的質譜圖才可能被鑒定。數據庫不僅要包含微生物所有的屬，也應包括種甚至亞種，因此，有一個完善的質譜數據庫意義重大。有兩個策略用于數據庫的建立，第一種策略是建立一個比較大的數據庫，包含每一個菌種的所有峰值信息，這就要求將每個菌種的所有參考菌株的信息全部納入其中，以便鑒定某菌株時可以產生良好的匹配。第二種策略是僅保留菌種的個別高強度特征峰值信息，這種方式對生長條件不同的菌株影響較小，匹配度較高[26]。有研究[31]關注不同的MALDI-TOF MS設備對匹配數據庫是否有影響，結果發現，對同一樣品不同設備產生的譜圖很接近，有60%的峰是重合的，大多數的差異僅僅是峰強度的差異。盡管因質譜模式改變導致譜圖有所改變，但多數峰是保守峰，這些保守峰可以被用作鑒定微生物的潛在標記物。而對于有些微生物未能被鑒定出來，或許因為它是新的物種或新分類，可以將新發現的物種添加到數據庫，按照物種分類不斷地去完善數據庫[32]。或者可以將一些不常見物種建立自己的內部數據庫，但這對于一般的常規實驗室仍然很難實現。因此，建立一個強大的數據庫仍然是科學家致力去突破的一個方面，尤其對于食品微生物，還沒有專門的商業化數據庫開發出來。

2.4 方法標準

方法標準的建立和發布是檢驗和技術交流的依據，也是食品安全監督檢查和仲裁的依據。目前關于MALDI-TOF MS技術的微生物檢測標準已經發布實施的只有GB/T 33682—2017《基質輔助激光解析電離飛行時間質譜鑒別微生物方法通則》和SN/T 3872—2014《出口食品中四種致病菌檢測方法MALDI-TOF-MS法》。第一個標準是通則標準，針對性和可操作性均不強，第二個標準只涉及沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae），對于極其復雜、種類繁多的食品微生物來說顯然是不夠用的。建立一套完整的標準體系對于MALDI-TOFMS技術在食品微生物方面的應用擴展非常重要，它會加速將MALDI-TOF MS技術普及到各個級別的實驗室中，使之成為一種常規檢驗。

3 討論和展望

近年來，MALDI-TOF MS已經成功應用于微生物的鑒定，顯示了其在細菌、酵母菌，真菌等鑒定方面的較強優勢。SENG P等[33]在實驗室對1 660個菌株進行了鑒定，將單克隆直接點于靶板上，每個單克隆點4個靶點，如果有2個或以上靶點鑒定的值是可信的，則認為這個鑒定是有效的。結果只有260個單克隆僅憑2個靶點閱讀未能得到鑒定，通過繼續閱讀剩余的2個靶點，則全部得到了鑒定。這項研究證實了MALDI-TOF MS技術的優越性：具有95%以上的鑒定正確率，其中84%鑒定到種的水平，11%鑒定到屬，有2.8%未能鑒定出，有1.7%盡管鑒定分值很高，但鑒定結果是錯誤的。同時，研究發現，MALDI-TOF MS技術與革蘭氏染色間沒有任何差異，可以將MALDI-TOF MS技術作為微生物鑒定的第一步，而無需先進行革蘭氏染色。這些研究成果肯定了MALDI-TOF MS技術在實驗室的重要地位。VAN VEENV等[34]的實驗方法與SENG P等[33]類似，只是對于鑒定不出來的每個菌株，增加了提取步驟，并且再次增加了2個靶點去進行識別。結果得到了97%的正確鑒定（92%鑒定到種，5.1%鑒定到屬）。在這項工作中，有61株酵母菌（分布于7個屬和12個種）也得到了鑒定，其中85.2%正確鑒定到種，96.7%正確鑒定到屬。這表明該技術非常有效，非常適合高通量樣品檢測，同時研究者也強調了數據庫的不完整、某些物種的缺失和擴充數據庫的必要性。

MALDI-TOF MS技術提供了一種快速、準確、廉價和高通量的微生物鑒定方式。有報道將不經過任何處理的經過細菌污染的樣品，利用數據庫的蛋白圖譜可以鑒定存在的細菌[35]。這預示著MALDI-TOF MS的寬譜定量已經有了初步的嘗試。縱然有這些優點，但在重復性、定量方面，經過眾多的改進，仍然沒有統一的方案解決，商業化的數據庫也還需要不斷完善和強大。

我國在MALDI-TOF MS領域的發展也突飛猛進，一批具有自主研發和生產能力的企業都推出了自己的產品，開發了諸多新型應用，建立了一些特色數據庫，相信在不遠的將來，隨著各種鑒定技術的聯合使用，或自身技術的突破，定能實現混合菌的檢測，或直接樣品的微生物檢測，而MALDI-TOF MS也有望成為首個由中國企業掌握全球領先技術和應用的通用型質譜儀。