微生物代謝組學及其在白酒釀造中的應用研究進展

王珂佳，邱樹毅*

（1.貴州輕工職業技術學院 輕工化工系，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

代謝組學作為系統生物學的重要組成部分誕生于20世紀90年代初，是一門繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后迅速發展起來的新興學科，它以生物體或細胞中所有相對分子質量1 000以下的小分子代謝產物作為研究對象，利用高通量、高靈敏度、高分辨率的現代儀器分析技術，結合模式識別等化學計量學方法進行定性和定量分析，揭示生物體或細胞相關代謝途徑及其變化規律[1]。

微生物是自然界中分布最廣、種類最多的物種。由于微生物系統相對簡單，基因數據豐富以及對微生物生理特征了解全面，代謝組學在微生物領域被越來越廣泛的應用。微生物代謝組學是代謝組學的重要研究領域，它主要是通過代謝圖譜對微生物代謝產物進行定量、定性分析，研究代謝機制，監測和優化發酵工藝。1992年，ELMROTH I等[2]首次利用氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS），結合化學計量學方法檢測了脂肪酸、氨基酸和糖類物質含量，以評估腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）在培養過程中的細菌污染情況，微生物代謝組學隨之應運而生。目前，微生物代謝組學已被廣泛應用于不同的研究領域[3]。近年來，利用代謝組學技術對微生物多樣性，誘變育種，功能基因，代謝途徑及其代謝產物功能進行研究成為了熱門方向。

中國白酒歷史悠久，經過六千多年的演化，形成了以大曲、小曲或大小曲聯用作為糖化發酵劑的固態發酵工藝[4]。該工藝是一個復雜的微生物混合協同作用過程，尤其在制曲和發酵環節，大曲、小曲等糖化發酵劑中的微生物利用自身酶系代謝和與原料作用代謝所產生的香氣物質進入白酒中，形成復雜而協調的酒體風味。近年來，微生物代謝組學技術被應用于白酒釀造中微生物菌落結構分析、產酶及代謝途徑研究[5-7]。在白酒生產過程中，通過對釀酒微生物細胞內代謝物質的分析來揭示風味物質的產生機制，實現發酵過程的動態監測，并據此優化發酵條件，改善酒體風味質量。本文圍繞微生物代謝組學的研究內容、研究過程及其在白酒風味物質定性、定量研究和釀造工藝優化方面的研究進行了概述，分析了微生物代謝組學在白酒釀造應用研究中的優勢和不足，為今后更好的利用微生物代謝組學解析白酒風味形成、發掘微生物多樣性資源和優化生產工藝奠定基礎。

1 微生物代謝組學的研究內容

1.1 微生物分類鑒定

目前，常用的微生物分類方法有表型分類法和基因型分類法。表型分類法是根據微生物形態學、生理生化學、生態學等的相似程度分群歸類；基因型分類法是指利用現代分子生物學技術，如16S rDNA測序，DNA雜交以及聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）指紋圖譜等對微生物系統發育相關性進行分類[8]。一般情況下，細胞在基因水平上存在細微差異都會在最終代謝產物上被體現出來，產生明顯不同的代謝表型，因此新興的代謝物圖譜分析技術成為一種全面、快速、高通量的微生物分類鑒定方法。ADNANI N等[9]利用液相色譜-質譜聯用技術（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法對海洋微生物的代謝物進行分析并鑒定出12個小單孢菌科。TRIEST D等[10]利用液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜法（liquid chro matography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS-MS）方法在臨床上鑒定真菌和其他微生物。CHENG C等[11]利用液相色譜-質譜聯用和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術對46株從12種不同的海洋海綿物種中分離出的放線菌進行代謝組學分析鑒定，顯示其分別為鏈霉菌（Streptomyces）SBT348和小單孢菌（Micromonospora）SBT687。SOGA T等[12]利用毛細管電泳-質譜聯用（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）系統研究了芽孢發生時枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的代謝譜變化情況，識別出代謝物1692種，并鑒別出其中的150種。熊萍等[13]采用核磁共振氫譜（1H-nuclearmagnetic resonance，1H-NMR）代謝組學方法對變異鏈球菌（Streptococcus mutans）、血鏈球菌（Streptococcus sanguis）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的代謝物譜進行分析，成功檢測了不同菌株細胞外代謝物的差別。SAMELISJ等[14]采用傅氏轉換紅外線光譜分析方法（Fouriertransform infrared spectroscopy，FTIR）獲得了傳統希臘Graviera奶酪中乳酸菌（Lactobacillus）胞外代謝物的紅外光譜圖，通過與數據庫比較實現了乳酸菌的鑒定。DUSKOVA M等[15]通過比較基因型技術PCR、擴增核糖體DNA限制性分析（16S-amplified ribosomal DNA restriction analysis，16S-ARDRA）以及代謝物圖譜分析技術基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDITOF-MS）對乳酸菌的鑒定能力，證明在種的水平上MALDITOF-MS更具有優勢，且準確率達到93%。除了分類鑒定外，利用代謝物譜分析技術還可以進行突變體的篩選，曹晶晶[16]利用代謝圖譜分析出擬南芥野生型與其突變體opr3存在明顯的代謝物差異。柴振光[17]利用代謝物譜分析技術構建了鹽芥激活標簽突變體庫和篩選出鹽芥轉座子標簽的突變體。代謝組學在微生物分類鑒定領域的應用彌補了傳統微生物分類鑒定手段的不足，正被更廣泛地應用于愈加深入的研究中。

1.2 代謝物分析與鑒定

代謝物分析和鑒定是代謝組學研究的關鍵內容。質譜分析技術因其具有高靈敏度和高特異性，被廣泛應用于代謝產物分析和鑒定。TAN K C等[18]采用氣相色譜-質譜聯用技術發現缺少Sch1基因的穎枯殼針孢（Septoria nodorum）突變菌株的次生代謝產物濃度是野生菌株的200倍，并鑒定該產物為交鏈孢酚。LOWE R G T等[19]采用GC-MS技術，非靶向分析了小麥病原菌孢子形成過程中相關代謝產物，證明殼聚糖在此過程中起著重要的作用。王越男等[20]采用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）代謝組學技術研究了不同發酵方式生產的酸奶中益生菌的活性，結果表明采用單一益生菌發酵得到的產物和采用益生菌與傳統酸奶發酵劑共同發酵得到的產物具有明顯的不同，同時，通過UPLC-QTOF-MS鑒定38個代謝物，分析出了兩種發酵方式得到的代謝產物的變化[21]。

1.3 發酵工藝研究

微生物通過發酵可以為人類提供諸如抗生素、酒類制品、功能食品及生物燃料等生活必需品。監控和優化發酵工藝，提高目標物產率和質量一直是相關領域的研究熱點。近年來，代謝組學分析方法被用于對代謝物進行定性、定量分析，從而找到代謝途徑或代謝網絡中影響目標物質產生的關鍵反應，并針對靶標酶進行遺傳改造，最終實現目標物產率及質量的提高。王向棟[22]以能夠轉化植物留醇生成9α-OH-AD的分枝桿菌（Mycobacterium）為研究對象，采用代謝工程的手段，對經過改造甾醇代謝途徑中與目的產物合成相關的多個關鍵酶基因，而構建的高效合成9α-OH-AD的基因工程菌株，進行發酵過程工藝優化，進一步提高了目的產物9α-OH-AD的得率。陶瑞[23]構建了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的代謝組學分析方法，研究了植物乳桿菌及其3株亞油酸異構酶系基因敲除株和植物乳桿菌的代謝特征，從極性小分子和脂肪酸這兩類代謝產物變化規律著手，進一步闡明了其生物轉化共軛亞油酸差異的原因。邵明龍[24]以甾醇轉化過程關鍵酶為目標，對新金色分枝桿菌（Mycobacterium aureus）轉化植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（androsterone-1,4-diene-3,17-diketone，ADD）過程中的關鍵酶：3-甾酮-Δ1-脫氫酶（3-sterone-Δ1-dehydrogenase，KSDD）、膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，Cho M）、甾酮C27單加氧酶（sterone C27 monooxygenase，SMO）和3-甾酮-9α-羥化酶（3-gonone-9-alpha-hydroxylase，KSH）進行研究，利用代謝工程策略，實現了ADD的高效積累。微生物代謝組學在發酵食品分析中的應用為發酵機理的研究提供了更準確、可靠的數據支持，進而為發酵工藝的優化提供明確的思路和方向。

2 微生物代謝組學的研究過程

微生物代謝組學的研究過程具有精確、靈敏、高通量等特點，通常包括樣品制備和預處理，代謝物的檢測、分析及鑒定和數據處理分析三個環節。

2.1 樣品制備和預處理

樣品制備和預處理是微生物代謝組學研究的初始步驟，包括快速取樣、淬滅以及代謝物的提取。

2.1.1 快速取樣

為防止底物濃度發生巨大變化，維持微生物代謝物穩定，一般利用連續擾動（Bio Scope）裝置[25]和快速換膜過濾（fast Swinnex filtration，FSF）裝置[26]進行樣品的快速采集。其中，Bio Scope裝置由連通發酵罐的透氧硅管組成，發酵液以恒定速度流過透氧硅管，管道中的塞子不斷運動，使發酵液與擾亂劑混合開始擾動，根據發酵進程，在管道的不同位置對發酵液進行取樣測定[27-28]；FSF裝置依靠注射器、空壓機等加壓設備，使用壓力驅動液體培養物通過Swinnex換膜過濾器進行快速過濾采樣和樣品提取，該方法可廣泛應用于厭氧液體培養系統[26]。

2.1.2淬滅

快速取樣后，需要快速淬滅酶活力，終止代謝反應，保持細胞完整性，從而獲得特定時間內樣品的真實信息。李泳榆等[29]應用高效液相色譜三重四級桿質譜聯用儀（high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry，HPLC-MS/MS），分析不同濃度甲醇作為淬滅劑以及不同離心收獲條件對鼠傷寒沙門菌胞內代謝物的泄漏影響及不同淬滅條件下DNA和蛋白質的滲出濃度，利用光密度回收率評估細胞完整性，結果表明使用-40℃體積分數為100%甲醇淬滅細胞并以3 000×g離心15 min收集菌體，胞內代謝物得到最大保留。VILLAS-BOAS S G等[30]提出了用冷甲醇溶液對酵母細胞進行淬火，然后用純甲醇萃取胞內代謝物的方法。楊泓喆[31]采用預冷的體積分數60%甲醇/0.9%碳酸銨溶液淬滅、珠磨法破碎細胞和N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N-methyl-N-（trimethylsilyl）trifluoroa-cetamide，MSTFA）衍生2 h，該方法從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中共鑒定到223種代謝物，包含了大量的氨基酸、有機酸和糖類物質。王亮[32]在研究釀酒酵母高濃度乙醇連續發酵體系振蕩行為時，建立了以冷甲醇法和冷氯仿-甲醇-緩沖液法進行釀酒酵母細胞代謝淬滅的方法。

2.1.3代謝物的提取

代謝物提取是微生物代謝組學研究中的重要步驟，在設計提取方法時應遵循在盡量減少或避免代謝物發生物理或化學性質變化的基礎上，提高提取回收率。常用的代謝物提取方法有冷甲醇、熱甲醇、高氯酸或堿、氯仿-甲醇混合液以及乙腈等。其中，冷甲醇法的適用性較好，對磷酸化糖、磷酸化有機酸和氨基酸類代謝物具有較好的提取效率；高氯酸提取法適用于核苷酸類物質和水溶性代謝物提??；氯仿-甲醇法適用于非極性氨基酸、脂類等代謝物提??；乙腈法適用于極性代謝產物提取[33]。BERROU K等[34]基于攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）和頂空吸附萃?。╤eadspace sorptive extraction，HSSE）的原理和對揮發性化合物更具特異性的優點，在頂空條件下用乙二醇/硅氧烷（ethylene glycol/silicone，EGS）攪拌棒和細菌培養條件下用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）同時提取，發現提取的化合物數量明顯增加，為細菌揮發性代謝產物提取提供了一種新的方法。戴詩皎等[35]在檢測濃香型白酒酒醅中總酯含量時，利用體積分數為95%乙醇浸提酒醅樣品。張崇軍等[36]研究表明，利用體積分數為55%的冷甲醇從大曲樣品中提取出黃曲霉毒素B1效率最好。徐延等[37]研究表明，提取醬香型大曲類黑素的最佳工藝條件為乙醇體積分數40%，提取溫度70℃，提取時間3 h，液固比17.5∶1（mL∶g）。然而，由于代謝物的多樣性，通常很難通過單一的一種提取方法提取全部胞內代謝物，因此結合不同的方法有利于提高代謝物提取效果。

2.2 代謝物的檢測、分析及鑒定

微生物代謝組學對代謝物進行檢測、分析及鑒定的主要技術有色譜-質譜聯用技術和核磁共振技術。

2.2.1 色譜-質譜聯用技術

色譜-質譜聯用技術具有較高的靈敏度和專屬性，可以實現對多個化合物的同時快速分析與鑒定，是微生物代謝組學研究的常用方法之一。目前，氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）因其兼備色譜的高分離度、高通量及質譜的普適性、高靈敏度和特異性，被廣泛運用到微生物代謝組學的研究中。陶瑞[23]通過利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）測定了植物乳桿菌生物轉化共軛亞油酸的含量；白雪等[38]利用電子鼻和氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對乳品風味成分進行分析。隨著技術發展，在微生物代謝組學研究領域相繼出現了液相色譜-質譜聯用（LC-MS）、全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用（full two dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）、離子色譜-電噴霧質譜（ion chromatography-electrospray mass spectrometry，IC-ES-MS）及毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）等技術。李俊等[39]采用頂空固相微萃?。╤eadspace-solidphase microextraction，HS-SPME）與全二維氣相飛行時間質譜相結合的方法，建立了白酒中揮發性風味成分分析方法，并對白酒中62種主要揮發性風味成分進行定性定量分析。

2.2.2 核磁共振技術

技術是目前微生物代謝組學研究的主要分析技術。能快速準確無損傷的對代謝產物中大多數化合物進行高通量分析并提供一定條件下的完整代謝圖譜。李兵[40]利用1H-NMR技術檢測白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌不同時段的代謝產物，繪制出了不同念珠菌（Candida）的特征性代謝核磁共振譜圖。張亞飛[41]建立了一種方便、快捷、無損的低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術對產鹽霉素菌株發酵過程中培養基的大豆油含量進行檢測。

2.3 代謝組學數據處理方法

通過色譜-質譜聯用技術和核磁共振技術所獲得的原始數據可采用K近鄰法、連續K近鄰法或多重插補法進行缺失值填補，應用正態、極差、均值、中位數、中心化或總強度標準化等方法進行預處理[42]，消除干擾因素后，利用主成分分析法（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘法（partial least squares，PLS）等進行統計學分析和生物信息學分析，再通過ECMDB、YMDB、HMP和KEGG等微生物代謝組學研究相關數據庫，有效進行生物標志物鑒定，從而揭示目標代謝產物及代謝途徑[3]。

3 微生物代謝組學在白酒釀造中的應用進展

3.1 白酒風味物質定性、定量研究

中國白酒釀造是以高粱、大米等谷物為原料，采用大曲、小曲或麩曲為糖化發酵劑，經過一系列復雜的酶化學反應、生化反應、有機化學反應及微生物代謝活動的過程。在此過程中，原料本身的香味物質，酒曲中微生物代謝產物、酒醅蒸餾中產生的香氣物質及窖泥微生物代謝產生的香氣物質，共同形成了白酒的風味物質[43]。目前，已經從中國白酒中檢測出風味物質成分達300種以上，包括醇類、酸類、酯類、氨基酸類、羥基化合物、縮醛、含氮化合物、含硫化合物、呋喃類化合物、酚類化合物、醚類等[44]。根據風味物質不同，中國白酒主要分為了醬香型、濃香型、清香型及兼香型等10種香型，應該說風味物質直接決定了白酒的香型與質量。近年來，廣大研究者利用氣相色譜-質譜聯用技術、多維氣相色譜-質譜聯用技術（multi-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，MD-GC-MS）及氣相色譜-聞香法（gas chromatography-olfac tometry，GC-O）等[45]微生物代謝組學研究手段對白酒中風味物質進行了定性、定量研究，為下一步研究其風味形成機制提供了理論基礎。徐巖[45]利用氣相色譜-聞香法（GC-O）研究了醬香型、濃香型、清香型、鳳香型、藥香型及兼香型白酒中的風味活性物質進行了系統研究，明確了濃香、清香、醬香等10種香型白酒的風味特征及重要風味物質及其微生物代謝機制，對提升白酒風味及其品質具有重要意義。劉燕梅等[46]采用頂空-固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術發現從濃香型白酒窖泥中篩選出的3株細菌的發酵產物主要為高級醇、高級酮等芳香類化合物，具有放香、助香及調香的作用，促進濃香型白酒風味形成。路江浩等[47]采用在線直接實時分析（direct analysis in real-time，DART）離子源串聯四級桿質譜技術，建立了一種在線檢測口腔中白酒揮發性風味物質釋放過程的方法，有效監測白酒品嘗過程中典型風味物質釋放的時間-強度變化，為進一步研究白酒品嘗中風味物質釋放規律和余味形成機制提供技術支撐。陳華明等[48]采用氣相色譜法對柔和醬香型和醬香型白酒中63種風味組分進行檢測，結合嗅閾值計算各樣品中風味組分的香氣活性值（odor activity value，OAV），確定29種主要風味組分進行主成分分析，發現柔和醬香型白酒區別于醬香型白酒的特征成分主要集中在第2主成分中，包括糠醛、3-羥基-2-丁酮、丁酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2-丁醇、正丙醇、丁酸以及己酸。周森等[49]采用固態發酵實驗對從牛欄山清香型大曲中分離釀酒酵母的可揮發性代謝產物進行了研究，發現其風味物質共28種，主要為酸、醇、酯3大類。何培新等[50]采用頂空固相微萃取（HS-SPME）結合氣相色譜-質譜研究了濃香型白酒窖泥中厭氧梭菌屬（Anaerobic clostridium）細菌的揮發性代謝產物主要為酯類、酸類、醇類和醛類，對窖泥中厭氧梭菌揮發性代謝物分析，有利于生物強化白酒風味物質和溯源及控制白酒異嗅物質產生。黃月等[51]利用氣相色譜質譜聯用、測定了脫皮青稞黃酒、不脫皮青稞黃酒及青稞麩皮中揮發性和半揮發性風味物質，發現未脫皮青稞黃酒和脫皮青稞黃酒在揮發性香氣成分上的差異主要來源于麩皮中富含的苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸通過代謝所產生的苯乙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基丙醇，表明青稞麩皮對黃酒風味的形成會生產積極影響。吳樹坤等[52]采用固相萃取和氣相色譜-質譜聯用法（SPME-GC-MS）對沉香型酒醅中分離產香芽孢桿菌并進行了發酵風味分析，共檢測到24種風味物質。綜上，微生物代謝組學技術在各個類型白酒及白酒釀造各個階段的風味物質鑒定方面的廣泛的應用，為進一步研究白酒風味形成機制提供了基礎，為不同風味白酒的釀造工藝優化及定向生產提供了理論支撐。

3.2 白酒釀造工藝優化

中國白酒獨特的釀造工藝有利于形成特定的微生物群落結構，促進相關酶反應、生化反應及代謝活動發生，產生特有的風味，可以說“工藝”決定了“風味”。因此，為了改善白酒風味，提升品質，近年來，微生物代謝組學技術被大量應用于優化釀造工藝領域。鄧劍清[53]利用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術檢測強化高溫大曲和普通高溫大曲香氣化合物組成，比較分析出兩者共有的香氣化合物有21種，其中強化高溫大曲中醬香型白酒的香氣成分的吡嗪類物質、苯甲醛、苯乙醇明顯髙于普通高溫大曲。將強化高溫大曲應用于生產醬香型白酒，有利于醬香型白酒的品質提高。李莉莉[54]通過微生物代謝組學技術，結合表型分析對16株釀酒酵母在不同脅迫下的應激機制進行了研究，探討了釀酒酵母耐性與發酵性能之間的關系，發現高溫耐性和山梨醇耐性都會顯著影響釀酒酵母的乙醇的生產能力，為利用釀酒酵母耐性的調控機制優化發酵工藝條件提供了理論依據。

4 展望

代謝組學作為一門新興學科已被廣泛地用于微生物代謝產物、發酵途徑機制及發酵工藝監控優化等研究領域。目前，微生物代謝組學已成為了代謝組學的一個重要分支學科，但其在發展上存在以下幾個方面的問題：①由于微生物培養條件的限制，導致了部分分析檢測技術在使用上有局限；②微生物代謝組學數據庫建設還不完善；③微生物代謝組學更多關注的是對代謝產物定性、定量研究，在相關代謝途徑及機制研究上深入不夠，特別在白酒釀造領域，目前主要集中在風味成分定性、定量研究方面，但對風味成分產生途徑和機制研究還不夠深入。因此，對于白酒風味物質的研究，應利用代謝組學原理探究釀造工藝的微生物代謝途徑及機制，剖析其微生態作用過程，找到相關功能菌株，運用基因工程技術對功能菌株行改良和選育以獲得強化菌株，將其運用于釀酒生產中，從而提高白酒品質、原料利用率和出酒率，實現“節能降耗、高產優質”的效果。同時，由此積累的經驗和方法也將助推微生物代謝組學的發展。