納米槲皮素對MCF－7和MCF/ADR細胞耐藥性影響研究

駱 濱，胡旭虎，王 強

(中南民族大學 藥學院，湖北 武漢430074)

1 引言

槲皮素是一種具有代表性的生物活性黃酮醇。促細胞分化，誘導細胞凋亡[1～12]。不但能增強腫瘤細胞對多種藥物的耐藥性，并且與多柔比星、順鉑等抗腫瘤藥物聯合使用可有效提升抗腫瘤效果[1]。但由于槲皮素分子結構上的特點，決定了其不太適合于直接作為藥品使用，近年來槲皮素的結構修飾和劑型改造工藝的增多，為其提供了非常好的研究機會[13～16]。槲皮素納米粒，槲皮素脂質體，槲皮素固體脂質納米粒，槲皮素膠束等是最常見的劑型[17～23]。納米槲皮素晶體也可稱為納米槲皮素懸浮液。它是通過將納米級的槲皮素微粒均勻分散在水溶液中以形成穩定的亞微米膠體分散體系。形成的納米藥物結晶粒徑非常小，一般在10～1000 nm，當藥物粒徑降至微米甚至降至納米級別時，其飽和溶解度會得到顯著提升。然而，通常需要在溶液中加入聚合物或表面活性劑以穩定體系[24]。隨著飽和溶解度的增加，藥物的溶出速率也增加。因此納米結晶不僅可以提高藥物的溶出率，而且可以提高藥物的飽和溶解度，從而提高像槲皮素等難溶性藥物的口服利用度[25]。

2 實驗部分

2.1 樣品、試劑和儀器

槲皮素原料藥(純度99.0%，國藥化學試劑有限公司)和對照品(中國國家藥品生物制品檢定所)，胰蛋白酶(Gibco，USA)，1640培養基(Gibco，USA)，胎牛血清(Gibco，USA)，CCK－8試劑(上海Beyotime)，鹽酸多柔比星(Aladdin)，MCF－7細胞(北京協和細胞庫)，MCF/ADR細胞(北京協和細胞庫)，Tween－20(gibco，USA)，Glycine(gibco，USA)，P－糖蛋白抗體(Abcom，UK)，β－action抗體(Abcom，UK)，山羊抗兔二抗(Abcom，UK)，RIPA裂解液(上海Beyotime)，脫脂奶粉(上海Yuanmu)，30%丙烯酰胺(PAEG，gibco，USA)，Tris－HCl緩沖液(p H6.8和p H8.8，gibco，USA)，十二烷基硫酸鈉(SDS，gibco，USA)，BCA蛋白試劑盒(上海Beyotime)，小分子蛋白質標準Mark(Applygen公司)，上樣緩沖液(loading buffer，普利萊公司)；TEMED(gibco，USA)，Tris base(gibco，USA)，其他試劑均為分析級，實驗用水為去離子超純水。ETSD4定時恒溫磁力攪拌器(IKA，German)，梅特勒－托利多PL203電子天平(Switzland)，UV－1800型紫外分光光度汁(SHIMADZU，Japan)，Millipore Direct8超純水儀(MERCK MILLIPORE，German)，Thermo fisher Nicolet iS10傅立葉紅外光譜儀(thermo，USA)，馬爾文Zetasizer Nano S90納米粒度分析儀(MalvernPanalytical)，Vortex－Genie2渦旋振蕩器(Scientific Industries，USA)，梅特勒－托利多FE20型p H計(Switzland)，超聲波清洗機(GuangDong GT Ultrasonic Inoustrialco＇ltd)，ThermoSavant ISS110 P1型離 心 濃縮儀(thermo，USA)，Thermo MICROCL21 R型冷凍離心機(thermo，USA)，Thermo311型細胞培養箱(USA)，吉爾森P型移液器系列(USA)，CHRIST ALPHA_1－4 LD型冷凍干燥機(German)，細胞計數器(南京漢龍實驗設備有限公司)，Thermo Multiskan FC型酶標儀(USA)，奧林巴斯CKX41－A32 FL/PH型熒光倒置顯微鏡(Japan)。

2.2 制備納米槲皮素

用電子天平精密稱取0.5 g槲皮素粉末置于棕色稱量瓶中，加入一定量NaOH溶液，密封避光攪拌放置24 h。然后緩慢加入0.12 mol/L HCl溶液，調節溶液至p H值7～7.5，停止滴定。將經p H值調節的槲皮素溶液濃縮至20 m L，得到濃度為25 mg/m L的槲皮素溶液。

2.3 納米槲皮素粒度測量

將適量的納米槲皮素溶液稀釋至合適的倍數，并通過納米粒度分析儀測量納米槲皮素粒度分布和Zeta電位。

2.4 紫外光譜比較納米槲皮素與乙醇及DMSO溶解的差異

稱取適量的槲皮素粉末，用DMSO，水和無水乙醇溶解并稀釋適當的倍數。使用相應的溶劑作為空白，并在200～800 nm的波長范圍內進行UV掃描，并記錄和比較紫外數據。

2.5 納米槲皮素對兩種腫瘤細胞的細胞毒性

取濃度為25 mg/m L的納米槲皮素溶液，用配好的胎牛血清細胞培養液將其稀釋成以下濃度梯度的溶液：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/m L。將稀釋好的每組納米槲皮素溶液加入樣品細胞孔板中并進行后續實驗。同時以100μg/m L的濃度制備槲皮素DMSO溶液。再用上述細胞培養液按以下濃度梯度配置新的槲皮素溶液：0、1.25、2.5、5、10、25、50、100μg/m L。將每組濃度梯度的槲皮素溶液加入上述的樣品細胞孔板中并進行后續實驗。

2.6 納米槲皮素對兩種腫瘤細胞耐藥性的影響

分別用含納米槲皮素和普通的細胞培養液稀釋鹽酸多柔比星成相對應濃度梯度，加入各處理好的細胞孔中培養，然后從各個濃度組中取出3個平行孔。1 h后檢測各孔的OD450值并記錄，計算各組細胞的細胞活度值并繪制活度關系曲線。

2.7 納米槲皮素對細胞吸收多柔比星的影響

用含有納米槲皮素的細胞培養基稀釋含有50μg/m L，100μg/m L的實驗培養基。將MCF－7細胞和MCF/ADR細胞在細胞培養基中培養，接種對數期生長的細胞到六孔板(200000細胞/孔)中。在后續培養中取四個孔接種細胞并用含50μg/m L及100μg/m L的納米槲皮素培養液分別培養48 h和72 h。取兩個孔并在正常培養基中培養72 h后用PBS緩沖液清洗。以上各組各取一孔加入含多柔比星0.5μg/m L的細胞培養液，將另一組添加到正常培養對照中。后續培養后加入正常培養基，用488 nm波長熒光激發觀察各孔中細胞內多柔比星的分布及強度然后拍照記錄。計數10000個細胞，計算每個細胞中多柔比星的熒光強度值并繪圖。

3 結果與討論

3.1 納米槲皮素結構表征

如圖1所示，納米級槲皮素的粒徑大小幾乎都在124 nm附近。制備納米槲皮素粒度分布在100～200 nm之間，顆粒相對均勻。如表1所示，混懸液的Zeta電位為－32.9 m V，形成了一種相對穩定的懸浮系統。

圖1 納米級槲皮素粒度分布

表1 納米級槲皮素Zeta電位值

3.2 紫外光譜比較納米槲皮素與乙醇及DMSO溶解的差異

DMSO溶解的槲皮素溶液UV對照結果如圖2(a)所示，水稀釋溶液結果如圖2(b)所示，無水乙醇溶解溶液結果如圖2(c)所示，槲皮素在250 nm和375 nm波長附近具有明顯吸收峰，并且UV吸收光譜非常相似。這表明以此方法制備的納米槲皮素在溶液中的分子結構非常穩定，并未發生變化。

圖2 DMSO(a)、納米槲皮素水溶液(b)及乙醇溶解槲皮素(c)紫外吸收圖譜

3.3 納米槲皮素對兩種腫瘤細胞的細胞毒性實驗

納米槲皮素對MCF－7細胞(A)和MCF/ADR細胞(B)的細胞毒性實驗結果顯示在圖3中。以DMSO溶解的槲皮素細胞毒性實驗如圖4所示，結果表明制備的納米槲皮素具有較低的細胞毒性，對MCF－7細胞的IC50值約為2 mg/m L，對MCF/ADR細胞的IC50值約為1.5 mg/m L，已知溶液中的DMSO量越多，對細胞的危害越大，若對DMSO溶液的量進行控制，槲皮素濃度便達不到要求，用含有0.5%DMSO的水溶液顯然不能制備200μg/m L濃度的槲皮素溶液。而以納米制劑形式存在的槲皮素則顯著提高了溶解性，溶解濃度可達到4 mg/m L。

圖3 納米槲皮素對MCF－7細胞(A)及MCF/ADR細胞(B)的細胞毒性

圖4 DMSO溶解槲皮素在MCF－7細胞(A)及MCF/ADR細胞(B)中的細胞毒性

3.4 納米槲皮素對細胞耐藥性影響實驗

繪制的活動曲線如圖所示。從圖5可知，以多柔比星處理MCF－7細胞時，得到IC50值為1.75μg/m L而用50μg/m L槲皮素溶液處理后的MCF－7細胞的IC50值上升為3μg/m L，這表明槲皮素可顯著提高MCF－7細胞對多柔比星的耐藥性，圖6也這表明用槲皮素處理的MCF/ADR細胞對多柔比星具有增強的抗性。這表明高濃度的槲皮素具有增加腫瘤細胞抗性的潛力。

圖5 納米槲皮素對MCF－7細胞耐藥性的影響

圖6 納米槲皮素對MCF/ADR細胞耐藥性的影響

3.5 納米槲皮素對細胞吸收多柔比星的影響

圖7和表2總結了每組多柔比星中觀察到的MCF－7細胞的分布和熒光強度圖。圖8和表3總結了各組多柔比星中MCF/ADR細胞的分布和熒光強度圖。從結果可以看出，細胞可吸收多柔比星，并且細胞核的熒光反應更強。槲皮素處理細胞的細胞內熒光強度明顯弱于未處理組。并且結果表明高濃度的槲皮素可以以濃度和時間依賴性方式降低細胞內多柔比星的濃度。從圖中還可以看出，高濃度的槲皮素處理后，2種腫瘤細胞的耐藥性明顯提升。通過計算每個細胞內多柔比星的熒光強度值可看出，細胞內熒光值與多柔比星的量成正比，熒光值越大，細胞毒性表現越明顯。

圖7 多柔比星及細胞流式儀檢測多柔比星在各組MCF－7細胞內的分布及熒光強度

圖8 多柔比星及細胞流式儀檢測多柔比星在各組MCF/ADR細胞內的分布及熒光強度

表2 多柔比星在MCF－7細胞內的熒光強度

表3 阿霉素在MCF/ADR細胞內的熒光強度

4 結論

(1)通過考察槲皮素的結構特征，確定了納米槲皮素最優的制備方法，制得的納米槲皮素粒徑小、溶解性提高。并紅外光譜和紫外光譜證實該制備方法不會改變槲皮素分子結構。

(2)通過比較納米槲皮素與DMSO溶解的槲皮素兩種腫瘤細胞的毒性實驗，已證實納米槲皮素對MCF－7和MCF/ADR細胞具有較低的細胞毒性作用，其IC50值大于1.5 mg/m L。與DMSO溶解法相比具有更好的溶解性。并且經過納米槲皮素處理的MCF－7和MCF/ADR細胞對多柔比星的耐受性明顯提高。

(3)利用現有熒光分析方法和手段[26]，可得知用高濃度槲皮素處理后的MCF－7細胞和MCF/ADR細胞內的多柔比星熒光強度明顯減弱，這表明細胞內多柔比星的含量顯著下降。