濃香型單層大曲與雙層大曲的質量對比分析

張曼，謝軍，衛春會，王洪，李子健，羅惠波,*

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢,643000) 2(四川理工學院，釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 自貢,643000)

大曲是以小麥為主或輔以豌豆和大麥等發酵制成的形狀較大并含有多種菌類、酶類及香味物質的微生態制品[1]，是釀酒生產中的糖化發酵劑和生香劑，同時也是釀酒生產的部分原料。由于微生物的代謝作用使得大曲含有豐富的風味物質及其前體物，這些風味化合物構成了大曲自身的“曲香”[2-3]。大曲按照制曲工藝可區分為傳統大曲、純種大曲、強化大曲和架子曲[4]，目前，對單層曲的工藝研究較為普遍，對多層曲的研究較少，而多層曲的研究方向主要是對工藝的探討、對制曲新設備的研發等，對單雙層曲的對比研究更少。大曲的品質與特點不僅影響其產酒率，且與基酒的品質與風格息息相關[5]，大曲成分比較復雜，我國大部分白酒企業的大曲質量標準都是根據理化指標和感官指標制定的[1,6]，雖然能在一定程度上反映出大曲的質量，但缺乏一些科學依據，并且不同的人對同一塊大曲的感官評價可能存在差異，主觀性較強。隨著對大曲質量標準的深入研究，設定大曲質量標準時將理化指標、生化指標和感官指標納入標準體系[7]。為了統一大曲的質量標準、用數據模型代替主觀性較強的感官評定，對單層大曲和雙層大曲的理化、生化、微生物指標進行考察很有必要。

該文主要通過測定濃香型單層曲和雙層曲在發酵過程中理化指標、生化指標、微生物量，分析其變化趨勢、差異及原因，將感官鑒定、理化指標、生化指標、微生物指標等納入因素范疇，通過打分制建立一個科學的評價體系，將傳統的感官鑒定與科學評價體系相結合來評價大曲質量的好壞。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品：四川邛崍古川酒廠，分別取單層曲和雙層架子曲發酵0 d、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、20 d、60 d(貯存1個月)、90 d(貯存2個月)的大曲，并對大曲進行相應的編號，單層曲：S0、S1、S3、S6、S9、S12、S15、S20、S1M(貯存1個月)、S2M(貯存2個月)；雙層曲：D0、D1、D3、D6、D9、D12、D15、D20、D1M(貯存1個月)、D2M(貯存2個月)。大曲粉碎后過30目篩，混合均勻后放置4℃冰儲存用于理化指標的測定，放置在-20℃冰箱里用于微生物指標的測定。

主要試劑：α-淀粉酶(50 000 U)、糖化酶(50 000 U)：山東西亞化學工業有限公司；溶菌酶、蝸牛酶、SDS(美國Sigma公司)；DNA提取液；苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇，分析純(成都市科龍化工試劑廠)；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit；QIAquick Gel Extraction Kit，Quant-iTPicoGreen定量試劑盒等。

1.2 儀器與設備

GZ-1200-X型恒溫層析柜：韶關廣智科技設備有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；MIK-6AT型溫濕度變送器：杭州美控自動化技術有限公司；APEG-DCO2-3-H型固定式二氧化碳檢測儀，APEG-DO2-3-H型固定式氧氣檢測儀：深圳市安帕爾科技有限公司；實時熒光定量PCR儀：TIB8600，泰普生物科學(中國)有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 大曲理化指標的測定

水分、酸度、氨態氮含量的測定方法參照文獻[8]；水分活度使用水活度儀進行測定[9]；淀粉的測定方法根據文獻[10]測定。

1.3.2 大曲生化指標的測定

大曲液化力、酯化力、糖化力和發酵力的測定方法根據文獻[11-12]測定。

1.3.3 微生物量的測定

測定采用熒光定量實時PCR法[13]，對粗提取的基因組DNA進行純化后，進行熒光定量PCR。以大曲總基因組DNA為模板，分別以引物對338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’),806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對細菌16S rRNA基因序列中的V3-V4可變區進行擴增，引物對ITS5F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’),ITS1R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)對真菌ITS1區進行擴增。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個循環。

1.3.4 大曲感官鑒定綜合評定方法

結合一些研究者[6]對大曲感官鑒定的標準，對大曲感官參數的設置及其權重分配進行綜合評定，見表1。

表1 大曲感官評分表Table 1 Sensory evaluation of Daqu

對貯存1個月和2個月的單層大曲和雙層大曲進行感官打分，所得感官評分記為S。其中，感官評分由5名以上酒廠專業制曲人員進行，最終取平均值記為最終評分。

1.3.5 大曲理化和生化指標綜合評定方法

大曲理化和生化指標對大曲質量影響較大，結合先前研究者對大曲質量指標參數的設置及其權重分配進行綜合評定[14]，見表2。

表2 理化和生化指標參數設置及權重分配Table 2 Parameters set for physicochemical and biochemical indexes and their weights distribution

由于大曲各理化和生化指標的單位不同即量綱不統一，數值上差異會很大，為了消除量綱的影響，該試驗將對大曲各指標進行歸一化處理，其計算公式為：

(1)

大曲酸度、液化力、糖化力、發酵力、酯化力、蛋白酶活力等指標為正效應，其計算公式為：

(2)

公式(1)和(2)中，yi是大曲各指標歸一化值；xi是大曲各指標測定值；xmax和xmin分別是大曲各指標測定的最大值與最小值。

大曲理化(Y1)、生化(Y2)和綜合指標(Y)的計算公式為：

(3)

(4)

Y=Y1+Y2

(5)

1.3.6 大曲微生物指標綜合評定方法

大曲微生物主要包括細菌和真菌，微生物的生物量可以體現出大曲的發酵性能，也可以反映出大曲的發酵狀態，對大曲質量影響也較大。對真菌和細菌的權重設置為7∶3[4]，大曲微生物綜合評定得分為M，對樣品進行綜合評分，計算公式為：

(6)

公式(6)中，M是大曲微生物指標綜合得分；x細i、x真i是大曲細菌和真菌的生物量值；x細max、x真max是大曲細菌和真菌生物量的最大值；x細min、x真min是大曲細菌和真菌生物量的最小值。

1.3.7 大曲綜合評價指標處理法

為了消除大曲各指標數量級和量綱對其加權評分值的影響，感官評分S、生化和理化指標Y和微生物指標M用公式(2)將其標準化，標準化之后分別用Z1、Z2、Z3表示。用線性加權法確定大曲綜合評價函數為Z，計算公式為：

Z=λ1Z1+λ2Z2+λ3Z3

(7)

公式(7)中，λ1、λ2、λ3分別為Z1、Z2、Z3的加權系數，滿足λ1>0、λ2>0、λ3>0，且三者之和等于1。通過查閱文獻[7]，了解到大曲各指標對其質量及釀酒生產貢獻的大小，取λ1=0.2、λ2=0.5、λ3=0.3，所以大曲指標綜合評價函數Z的表達式如下：

Z=0.2Z1+0.5Z2+0.3Z3

(8)

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 大曲理化指標的動態分析

大曲理化指標是評價大曲質量的重要組成部分，能反映微生物的結構分布和代謝途徑。水分含量在制曲過程中與微生物的生長和酶的生成密切相關。由圖1可知，單層大曲和雙層大曲水分變化總體呈降低趨勢，發酵9 d后雙層曲的水分含量較單層曲低，這是因為雙層曲曲溫較高，水分的擴散蒸發速度更快，但最終單雙層曲含水量趨于一致；大曲水活度在發酵前12 d降低緩慢，而在后期降低速率較快，這是由于單層大曲和雙層大曲微生物先后再次大量繁殖，消耗了自由水[15]；貯存2個月后單層大曲和雙層大曲的水活度都趨于0.62左右，此時微生物幾乎停止代謝而處于休眠狀態。

圖1 水分和水活度的變化Fig.1 Changes of moisture content and water activity

圖2 酸度和淀粉含量的變化Fig.2 Changes of acidity and starch content

由圖2可知，大曲酸度隨著發酵時間呈波浪式上升，大曲中酸度的增加主要是由于大曲中生酸菌的生酸作用，尤其是醋酸菌和乳酸菌等，最終酸度分別為1.46 mmol/10g和1.52 mmol/10g；單層大曲在發酵9～12 d時酸度短暫上升，可能是因為高溫刺激了某種產酸耐熱芽孢桿菌的生長導致酸度增加[16]；單層大曲和雙層大曲在發酵前20 d淀粉含量差異較大，由于采用的樣品未處于絕干狀態，水分降低速度相對較快，淀粉變化總體呈上升趨勢；在貯存期時兩者含量相近并趨于穩定，最終淀粉含量在54%左右；發酵1～3 d單層大曲淀粉含量有一個明顯的降低趨勢，而雙層大曲則恰好相反，說明單層大曲中霉菌和酵母菌生長更為旺盛，單層大曲的穿衣效果也較雙層大曲要好。

2.2 大曲生化指標的動態分析

大曲的生化指標是衡量大曲質量的重要指標，由圖3可知，發酵過程中單層大曲和雙層大曲的液化力總體來說都先增加后降低，最后在貯存期趨于平穩，單層大曲液化力高于雙層大曲；發酵1～6 d單層大曲的液化力增長較快，且較雙層大曲液化力高；發酵12 d至發酵后期明顯回升，發酵20 d時達到最大值，單雙層曲的液化力分別為1.8 g/(g·h)和1.2 g/(g·h)；由于缺乏營養物質和水分，微生物無法進行正常的代謝生長[17]，發酵20 d至貯存期大曲液化力顯著降低且2種大曲液化力相差不大；糖化力在發酵前3 d明顯下降，且雙層大曲糖化力要大于單層大曲，在發酵12～20 d單層大曲糖化力要大于雙層大曲，且雙層大曲糖化力顯著性下降，此階段雙層大曲曲溫較單層大曲高，高溫條件抑制或殺死了這類微生物，使得糖化酶代謝減少；大曲經歷貯存期后糖化力降到最小值[18]，且單層大曲較雙層大曲高，分別為256 mg/(g·h)和233 mg/(g·h)。

圖3 液化力和糖化力的變化Fig.3 Changes of liquefaction and saccharification levels

由圖4可知，發酵前3 d單層大曲和雙層大曲發酵力都呈上升趨勢，此時酵母菌生長較為旺盛，并且單層大曲發酵力要高于雙層大曲；發酵3 d后大曲發酵力呈現出降低趨勢，這是由于發酵初期溫度對酵母菌起到一個高溫篩選作用，少部分能耐熱的酵母菌存活了下來，隨著后期發酵溫度的降低，一些酵母菌又開始大量繁殖；經過2個月貯存后，大曲發酵力達到1個較低水平，單層大曲發酵力高于雙層大曲，分別為0.6 g/(g·72h)和0.3 g/(g·72h)；大曲氨態氮的量總體呈現降低的趨勢，在貯存期趨于穩定，單層大曲和雙層大曲在發酵過程中變化波動都較大，說明大曲微生物代謝揮發性風味化合物具有時期性而不是連續性代謝產生；沈才洪等[14]認為，氨態氮和淀粉消耗率是大曲生香力的特征指標，發酵第9天的大曲處于排潮生香期，在發酵過程中氨態氮被微生物利用，從而使其含量降低，此外，隨著發酵過程中溫度的升高也可加速美拉德反應的進行，使得氨態氮的量減少[10,19]；貯存2個月后大曲氨態氮的量處于較低水平為356 mg/100g，此時大曲具有濃郁的曲香味。

由圖5可知，隨著發酵時間的增加，單層大曲酯化力緩慢上升后趨于穩定，且波動相對較小，而雙層大曲酯化力在發酵前6 d波動較大；發酵前6 d單層大曲酯化力較雙層大曲高，而在發酵9 d后則相反，可能原因是高溫條件能在一定程度上刺激產酯化酶微生物的生長；貯存2個月后單層大曲酯化力大于雙層大曲，分別為391 mg/(50g·7d)和371 mg/(50g·7d)；隨著發酵時間的增加，大曲蛋白酶活力呈現出緩慢增加的趨勢，單層大曲和雙層大曲在此過程中交替出現升高降低的波動變化現象；單層大曲和雙層大曲在發酵后期分別達到最大值，分別為106 U/g和108 U/g，而在貯存期時又急劇降低，使酶活處于較低水平，且單層大曲酶活較雙層大曲高，此時蛋白酶活力分別為18 U/g和13 U/g。

圖4 發酵力和氨態氮的變化Fig.4 Changes of fermentation force and ammonia nitrogen content

圖5 酯化力和蛋白酶活的變化Fig.5 Changes of esterification level and protease activity

2.3 濃香型單層大曲和雙層大曲微生物量測定

通過熒光定量實時PCR法分別得到單層大曲和雙層大曲真菌ITS和細菌16S rRNA基因的拷貝數，從而得到發酵過程中真菌生物量和細菌生物量及變化規律，即表3、表4所示。

表3 單層大曲微生物量Table 3 Fungal biomass of single-layer Daqu

表4 雙層大曲微生物量Table 4 Fungal biomass of double-layer Daqu

由表3可知，單層大曲發酵過程中前1～3 d真菌生物量增加較快，發酵第6天生物量相對減少，而6 d后真菌生物量緩慢增加，經過貯存期后生物量相對穩定，發酵第20天時生物量達到最大；單層大曲中細菌16S rRNA基因拷貝數總體呈波浪式變化，在第6天時生物量達到最大，與發酵第6天相比第9天有一個明顯的減少趨勢，同樣的相比于第12天，發酵第15天生物量也有一個明顯的減少趨勢，說明2次翻曲對細菌生物量的減少有一定促進作用。

由表4可知，雙層大曲在發酵1～3 天真菌生物量明顯增加；第6天時生物量減少；而發酵第6天后真菌生物量有所回升，經過貯存期后生物量相對穩定，發酵第15天生物量達到最大；雙層大曲中細菌生物量隨著時間的增加也呈現波動式起伏，但沒有單層大曲劇烈且每個發酵階段的生物量總體較單層大曲小，發酵第9天相對于第6天也有一個明顯的減小趨勢，說明第一次翻曲對細菌生物量的減少有一定促進作用。

2.4 大曲綜合評分

基于單雙層大曲的理化指標、生化指標、微生物量等數據，選擇樣品進行感官鑒定評分、生理生化指標評分、微生物指標評分，用科學的評價體系代替主觀性較強的感官評定，最后對以上指標進行綜合判斷，從而評價單雙層大曲質量的好壞。

由于貯藏期的大曲樣品理化、生化、微生物量趨于穩定，因此選擇S1M、S2M、D1M和D2M樣品通過表1的評分方式進行感官鑒定評分，最終得到平均分分別為93、92、81、79。按照表2的理化和生化指標參數設置及權重分配情況將大曲的理化、生化、微生物指標值進行分配，并帶入相應的計算公式，得到感官鑒定得分、生化和理化得分、微生物得分和大曲綜合得分(表5～表8)。

表5 感官鑒定得分Table 5 Sensory evaluation scores

表6 生化和理化指標得分Table 6 Physicochemical and biochemical indexes scores

表7 微生物指標得分Table 7 Microbial indexes scores

表8 大曲綜合得分情況Table 8 Comprehensive scores of Daqu

由表8可知，貯存期大曲樣品中S2M綜合得分最高為0.89分，D2M得分最低為0.21分，得分大小情況為S2M>S1M>D1M>D2M，由此可知，單層大曲的質量要較雙層大曲好。在對大曲感官評分(S)過程中發現雙層大曲穿衣效果、菌絲飽滿度和曲香味較單層大曲差。在對大曲理化和生化指標評分(Y)過程中發現蛋白酶活力在雙層大曲評分中較低，而液化力、糖化力、發酵力的評分隨著貯存時間的增加在雙層大曲中不斷的降低。而對微生物指標評分(M)過程中發現雙層大曲真菌生物量的得分較低，對其評分影響較大。綜合來看，單層大曲的質量好于雙層大曲。

2.5 大曲各指標間的相關性分析

大曲各指標間均存在相互影響關系，大曲各指標間的相關性分析結果見表9、表10。

表9 單層大曲指標間相關性分析Table 9 Ccorrelation analysis of single-layer Daqu indexes

注：*表示在0.05水平上顯著相關，**表示在0.01水平上顯著相關。

由表9可知，單層曲真菌生物量與水活度的相關性系數為-0.575，說明水活度與真菌生物量呈負相關[17]；真菌生物量與蛋白酶活力、液化力、發酵力的相關性系數分別為0.446、0.607、-0.489，說明真菌生物量與蛋白酶活力、液化力呈正相關，與發酵力呈負相關。細菌生物量與水活度的相關性系數為0.639，說明水活度與細菌生物量呈顯著(p<0.05)正相關；細菌生物量與糖化力的相關性系數為0.476，說明細菌生物量與糖化力呈正相關。蛋白酶活力與液化力、糖化力的相關性系數分別為0.803、0.656，說明蛋白酶活力與液化力呈極顯著(p<0.01)正相關，與糖化力呈顯著(p<0.05)正相關。糖化力與水活度呈顯著(p<0.05)正相關，發酵力與水活度呈正相關。

表10 雙層大曲指標間相關性分析Table 10 Correlation analysis of double-layer Daqu indexes

注：*表示在0.05水平上顯著相關，**表示在0.01水平上顯著相關。

由表10可知，雙層曲真菌生物量與蛋白酶活力、液化力的相關性系數分別為0.657和0.588，說明真菌生物量與蛋白酶活力呈顯著(p<0.05)正相關，與液化力呈正相關；細菌生物量與水活度的相關性系數為0.658，說明水活度與細菌生物量呈顯著(p<0.05)正相關；細菌生物量與發酵力的相關性系數為0.571，說明細菌生物量與發酵力呈正相關；蛋白酶與液化力呈顯著(p<0.05)正相關；糖化力與水活度呈極顯著(p<0.01)正相關；發酵力與水活度呈正相關。

3 結論

從理化指標來看，單層大曲和雙層大曲理化性能變化差異不大，貯存期單層大曲和雙層大曲水分含量及水活度近似，總體呈降低趨勢；在酸度方面，雙層大曲略高于單層大曲的酸度(1.52 mmol/10g>1.46 mmol/10g)；在發酵前20 d單層大曲淀粉含量高于雙層大曲淀粉含量，而在貯存期時二者含量相近并趨于穩定，最終淀粉含量在54%左右，單層曲的穿衣效果較雙層曲要好[20]。

從生化指標來看，在發酵期液化力最大值，分別為1.8 g/(g·h)和1.2 g/(g·h)，貯存期大曲液化力顯著降低，單層大曲的液化力略高于雙層大曲；大曲經歷貯存期后糖化力降到最小值，且單層大曲較雙層大曲高[256 mg/(g·h)>233 mg/(g·h)]；經過貯存期后單層大曲發酵力大于雙層大曲[0.6 g/(g·72h)>0.3 g/(g·72h)]；貯存2個月后單層大曲酯化力大于雙層大曲[391 mg/(50g·7d)和371 mg/(50g·7d)]；單層大曲酶活較雙層大曲高，貯存期分別為18 U/g和13 U/g。

單層大曲的質量要較雙層大曲好，雙層大曲在感官鑒定中的穿衣效果、菌絲飽滿度和曲香味等項目的評分較低，在理化和生化指標評價中的蛋白酶活力項評分較低，而液化力、糖化力、發酵力的評分隨著貯存時間的增加在不斷的降低，而在微生物指標評價中的真菌生物量得分較低，最終導致雙層大曲評分較低；在雙層大曲發酵過程中，水活度與細菌生物量呈顯著(p<0.05)正相關，與糖化力呈極顯著(p<0.01)正相關；真菌生物量與蛋白酶活力呈顯著(p<0.05)正相關；蛋白酶活力與液化力呈顯著(p<0.05)正相關。