動態高壓微射流技術超微細化鰱魚魚骨

沙小梅，肖萬榕，葉云花，涂宗財,3*，危紫徽，潘鳳濤，潘海艷，張露，劉堯，季中春

1(江西師范大學 功能有機小分子教育部重點實驗室&生命科學學院，江西 南昌，330022) 2(江西師范大學 體育學院，江西 南昌，330022) 3(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047) 4(鹽城市怡美食品有限公司，江蘇 鹽城，224300)

魚骨富含鈣、磷和蛋白質等成分，營養價值十分豐富[1]，添加于食品中，可以增加食品的營養價值[2]。對魚骨進行超微細化加工是促進魚骨和食品基質有機融合，提升魚骨利用價值的有效手段，目前，對魚骨進行超微細化的技術主要有球磨法[3-4]、酶法結合超微粉碎技術[5]等。課題組前期運用亞臨界水技術實現了鰱魚魚骨的軟化[6]，若能進一步對軟化后鰱魚魚骨進行超微細化處理，將有望拓展魚骨的用途。

動態高壓微射流(dynamichighpressuremicrofluidization,DHPM)作為一種集輸送、混合、超微粉碎、加壓、膨化等多種單元操作于一體的新興動態高壓均質技術[7]，其處理條件(如高速剪切、壓力梯度、高速沖撞等)十分劇烈，易導致大分子聚合物發生降解[8-10]。DHPM處理能有效地改善蛋白質的溶解性、穩定性、起泡性、乳化性和致敏性[11]等，同時改變蛋白質和酶的結構和構象[12]；DHPM處理能改變淀粉的凝膠硬度、彈性、內聚性、膠著性和咀嚼性等[13]，并且能使非淀粉多糖分子降解，改變其表觀黏度、凝膠性能、吸水性、持水性、流動性、粒徑等性質[14]。目前運用DHPM超微細化鰱魚魚骨的研究還較少。

本文以亞臨界水處理后的魚骨為原料，利用DHPM不同壓力和次數處理，研究DHPM處理對鰱魚魚骨粒度分布、微觀結構、表面疏水性、游離氨基含量和鈣離子溶出量的影響，為魚骨的超微細化提供依據，為魚骨的精深加工提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鰱魚魚骨，購自洪湖市井力水產食品股份有限公司；其他試劑均屬于分析純。

1.1.2 儀器與設備

M-7125型動態高壓微射流設備，美國Microfluidics公司；BioTek Synergy H1全功能酶標儀，美國BioTek儀器有限公司；BT-9300HT激光粒度分布儀，遼寧丹東百特儀器有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立(HITACHI)有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚骨的預處理

將冷凍的鰱魚魚骨置于室溫約25 ℃下解凍，用沸水加熱1 min，將魚骨表面殘存的魚肉和膜性組織剔除，經蒸餾水沖洗干凈后，置于37 ℃的烘箱中烘12 h，用自封袋封好放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 魚骨的軟化

根據課題組前期研究結果，采用亞臨界水技術結合醋酸軟化鰱魚魚骨[6]，即將魚骨與0.9 mg/L醋酸以料液比1∶25(g∶mL)混合，采用亞臨界水處理，溫度設定為124 ℃，時間設定為1.5 h。

1.2.3 DHPM對魚骨進行超微細化處理

(1)將軟化后魚骨先經過膠體磨和均質機預處理，再分別進行0、40、60、80、100、120 MPa的DHPM處理3次，研究不同的DHPM壓力對亞臨界水處理后魚骨細化效果的影響。

(2)將軟化后魚骨先經過膠體磨和均質機預處理，再于100 MPa的DHPM壓力下分別處理0、1、3、5、7次，研究不同的DHPM處理次數對亞臨界水處理后魚骨細化效果的影響。

1.2.4 魚骨粒度的測定

用蒸餾水將魚骨配制為1.0 mg/mL的溶液，采用納米激光粒度儀測定魚骨在溶液中的粒度分布[15]。以魚骨樣品的數量百分比為橫坐標，粒徑為縱坐標繪制曲線，研究DHPM處理對魚骨粒度分布的影響。

1.2.5 微觀結構

將DHPM處理后的魚骨溶液凍干成魚骨粉，將魚骨粉樣品置于樣品臺的導電雙面膠上，采用掃描電鏡在低真空模式下放大5 000倍拍攝魚骨粉的微觀結構[16]。

1.2.6 表面疏水性

采用ANS熒光探針法測定不同DHPM處理條件下魚骨粉表面疏水性的變化[17]。采用超純水溶解凍干過后的魚骨粉得到系列濃度的魚骨樣品溶液，取4 mL樣品溶液與20 μL 8 mmol/L ANS溶液(0.01 mol/L，pH 8.0)混合后，測定其熒光強度。測定條件：激發波長為370 nm，發射波長為400～600 nm，掃描速度為2 400 nm/min，激發和發射的狹縫寬度均為5 nm，電壓為400 V。以魚骨粉濃度(mg/mL)為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，采用線性回歸分析進行曲線擬合，曲線的斜率即為魚骨粉的表面疏水性(H0)。

1.2.7 魚骨中鈣含量的測定

將DHPM處理的魚骨溶液離心取上清液后，用蒸餾水稀釋一定倍數，加入3 mL三乙醇胺和5 mL氨性溶液，然后滴入2滴鉻黑T指示劑，最后以0.02 mol/L的EDTA標準溶液滴定，當溶液由酒紅色變成藍色即為滴定終點，根據標準回歸方程求解溶液中的鈣離子含量，平行測量3次[18]。

1.2.8 魚骨中游離氨基含量的測定

參考SERPEN等[19]的方法并稍作修改，魚骨中游離氨基的含量采用OPA法測定。準確稱取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入200 g/L的十二烷基硫酸(SDS) 2.5 mL、硼砂(0.1 mol/L) 25.0 mL和β-巰基乙醇100 μL，最后用蒸餾水定容到 50 mL，即為OPA試劑，此試劑要現配現用。測定時，將DHPM處理的魚骨溶液離心取上清液作為樣品待用，取1.0 mL OPA試劑于試管中，加入50 μL樣品，混合均勻，放入35 ℃水浴中反應2 min后在340 nm下測吸光度(A340nm)，另取1.0 mL OPA試劑于試管中，加入50 μL水作為空白對照。用相同的方法，以甘氨酸代替樣品作出標準曲線，根據曲線計算樣品中游離氨基的含量。

2 結果與分析

2.1 DHPM處理對魚骨粒度分布的影響

DHPM處理對魚骨粒度分布的影響如圖1所示，結果表明，不同DHPM處理壓力和處理次數都能顯著地減小魚骨的粒徑。經0、40、60、80、100和120 MPa的DHPM處理后，魚骨的D97(即魚骨顆粒累計粒度分布百分數達到97%時所對應的粒徑)分別為88.39、39.07、34.8、27.19、24.71和25.89 μm。經DHPM處理0、1、3、5和7次后，魚骨的D97分別為88.39、33.7、24.71、24.69和25.39 μm。由圖1-A可知，魚骨的粒徑隨DHPM處理壓力的增大而減小，當壓力增加到100 MPa時，粒徑達到最小，降低至未經DHPM處理時魚骨顆粒D97的28%。而后，隨著壓力的增大，120 MPa的DHPM處理后魚骨顆粒的D97有所增大。這表明DHPM處理過程中的強力剪切，高速沖擊和高頻振動等作用能有效降低魚骨顆粒的大小，然而，當DHPM處理壓力為120 MPa時，魚骨顆粒可能在范德華力、靜電相互作用力等影響下重新聚集，導致魚骨粒徑稍有增加。這一結果與DHPM處理后玉米淀粉[20]、乳清蛋白[21]、大豆膳食纖維[22]等粒徑變化結果相一致。由圖1-B可知，當DHPM處理壓力不變(100 MPa)，魚骨的粒徑隨DHPM處理次數的增加而減小，當處理次數為3～5次時粒徑達到最小。隨著DHPM處理次數的進一步增加，魚骨的粒徑呈現出小幅度增大趨勢，當處理次數為7次時D97為25.39 μm，可能是因為過度的處理在一定程度上促使魚骨分子間發生聚集，高頻的聚集現象和極高的能量密度使魚骨顆粒產生了“過處理現象”[23]。

A-DHPM處理壓力對魚骨粒度分布的影響； B-DHPM處理次數對魚骨粒度分布的影響圖1 DHPM處理對魚骨粒度分布的影響Fig.1 The effect of DHPM on particle size distribution of fish bone

2.2 DHPM處理對魚骨微觀結構的影響

DHPM處理對魚骨微觀結構的影響如圖2、圖3所示。結果表明，DHPM處理能有效細化鰱魚魚骨。圖2為不同DHPM壓力處理后魚骨的掃描電鏡圖，未經處理的魚骨樣品為薄片狀。DHPM處理后，魚骨的整體結構被破壞，伴隨著顆粒狀碎片的出現。隨著DHPM處理壓力的增加，碎片顆粒的粒徑逐漸減小。當DHPM處理壓力為80～100 MPa時，魚骨的顆粒最多、粒徑最小。然而，100 MPa DHPM處理后的魚骨部分碎片顆粒呈現聚集現象。這與鐘俊楨等[24]所研究的動態高壓微射流對β-乳球蛋白微觀結構的影響有相似之處：隨著DHPM處理壓力的逐漸增大，β-乳球蛋白分子被逐漸打散，大部分顆粒逐漸變細，然而有小部分β-乳球蛋白分子在經過100 MPa處理后，發生了部分團聚現象。當處理壓力為120 MPa時，聚集現象明顯增加，大部分顆粒粘連在一起，團聚成片狀。這與納米激光粒度儀檢測溶液中魚骨粒度分布的結果一致。

圖3為不同次數DHPM處理后魚骨的掃描電鏡圖，由圖可知，未經處理的魚骨樣品微觀結構呈現出片狀薄片。隨著DHPM處理次數的增加，魚骨的片狀微觀結構被破壞，魚骨碎片顆粒的粒徑先減小后增大。當DHPM處理次數為3次時，魚骨顆粒的外觀形貌最小。然而，當DHPM處理次數為5～7次時，魚骨表面出現典型的聚集現象，魚骨顆粒間已發生明顯粘連和團聚，即出現“過處理現象”[23]。

A-0 MPa; B-40 MPa; C-60 MPa; D-80 MPa; E-100 MPa; F-120 MPa圖2 不同壓力DHPM處理后魚骨的掃描電鏡圖Fig.2 The scanning electron microscope photographs of fish bone treated by DHPM with different pressures

A-0次;B-1次;C-3次;D-5次;E-7次圖3 不同次數DHPM處理后魚骨的掃描電鏡圖Fig.3 The scanning electron microscope photographs of fish bone treated by DHPM with different times

2.3 DHPM處理對魚骨表面疏水性的影響

魚骨中的蛋白質大多數為Ⅰ型膠原蛋白，其空間結構會影響表面疏水性[25]。DHPM處理能改變蛋白質的高級結構，使蛋白質發生去折疊[26]，因此，本文進一步研究了DHPM處理對魚骨表面疏水性的影響，結果如圖4所示。隨著DHPM處理壓力的增加，魚骨表面疏水性先增加后降低(p<0.05)，在40 MPa時達到最大值。出現這種現象的原因可能是DHPM處理使魚骨中蛋白質分子的空間結構發生變化，破壞了其內部的疏水相互作用，使疏水基團暴露，從而大大提高了魚骨的表面疏水性。而經過60～80 MPa的DHPM處理后，由于魚骨顆粒的分散，分子間的親水區域被暴露，導致表面疏水性的下降[27]。之后隨處理壓力增大，魚骨顆粒的聚集可能導致部分蛋白質分子聚集，疏水基團被掩蔽，使其表面疏水性再次降低。這一現象與遲玉杰等[28]所研究的動態高壓微射流對蛋清蛋白表面疏水性的影響相似。由圖4-B可知，DHPM處理壓力不變(100 MPa)時，處理次數的不同對魚骨表面疏水性會產生不同的影響。當處理次數為1次時，其表面疏水性高于未經處理的魚骨樣品(p<0.05)，SHEN等[29]研究表明，DHPM處理能使蛋白質發生去折疊、暴露內部疏水基團，從而提高表面疏水性。而隨處理次數的增加，魚骨表面疏水性均低于未經處理的樣品。可能的原因是隨處理次數的增加，蛋白質將會聚集，其內部疏水基團被掩蔽[28]，導致疏水性低于未經處理的魚骨樣品(p<0.05)。

A-不同處理壓力對魚骨表面疏水性的影響； B-不同處理次數對魚骨表面疏水性的影響圖4 DHPM處理對魚骨表面疏水性的影響Fig.4 The effect of DHPM treatment on the surface hydrophobicity of fish bone

2.4 DHPM處理對魚骨鈣離子含量的影響

DHPM處理對魚骨鈣離子含量的影響如圖5所示。由圖5-A可知，魚骨中鈣離子含量隨DHPM處理壓力的增加，整體呈現先升高后降低的趨勢，并在處理壓力為80 MPa時，魚骨中鈣離子含量達到最大值。原因可能是繼亞臨界水處理后，40～80 MPa的DHPM處理進一步破壞了魚骨內部膠原纖維的網狀結構和羥基磷灰石結晶的結構，有利于鈣離子更大程度地析出[30]。而當壓力高于80 MPa時，過高的壓力使得魚骨部分碎片顆粒呈現聚集現象，導致魚骨內部結構變得更加緊湊，不利于鈣離子的析出，從而使鈣離子含量降低。DHPM處理次數對魚骨中鈣離子溶出量的影響如圖5-B所示，當DHPM處理次數為1次時，魚骨中鈣離子溶出量較對照組稍有降低，但變化程度不大。隨著DHPM處理次數的增加，魚骨中鈣離子溶出量增加，然而DHPM處理3、5和7次的魚骨鈣離子溶出量無顯著性變化。可能是由于多次的DHPM處理已使魚骨顆粒與水分子發生充分接觸，因而鈣離子溶出量呈現出穩定值。

A-不同處理壓力對魚骨鈣離子含量的影響； B-不同處理次數對魚骨鈣離子含量的影響圖5 DHPM處理對魚骨鈣離子含量的影響Fig.5 The effect of DHPM treatment on the calcium ion content of fish bone

2.5 DHPM處理對魚骨游離氨基含量的影響

DHPM處理對魚骨游離氨基含量的影響如圖6所示。魚骨經不同處理壓力和次數的DHPM處理后，游離氨基含量均有所降低。由圖6-A可知，當DHPM處理壓力從40 MPa增加到60 MPa時，可能由于魚骨顆粒的分散，蛋白質分子擺脫束縛，游離氨基含量呈現出增加的趨勢(p<0.05)。然而，隨著壓力的進一步增加，魚骨中蛋白質分子發生去折疊，部分游離氨基被包裹，導致游離氨基含量表現出降低的趨勢[31](p<0.05)。DHPM處理壓力達到120 MPa時，游離氨基含量有所上升，據郭麗萍利用超高壓結合熱處理對豬肉蛋白的研究可知，壓力可以穩定氫鍵，使蛋白質的結構趨于穩定，而靜電相互作用和疏水相互作用在壓力的作用下被削弱，可導致蛋白質有序結構的減少，無序結構增多[32]，這一現象會引起游離氨基含量的上升。由圖6-B可知，魚骨游離氨基含量隨DHPM處理次數的增加呈現出先降低后增加的趨勢(p<0.05)，并在處理次數達到5次時，游離氨基含量達到最低。出現該現象的原因可能是DHPM處理次數的增加導致魚骨顆粒聚集，部分游離氨基被包裹，使其含量降低，之后當處理次數達到7次時，靜電相互作用和疏水相互作用在壓力的作用下被削弱，使蛋白質有序結構減少，無序結構增多[32]，導致游離氨基含量再次增加。

A-不同處理壓力對魚骨游離氨基含量的影響； B-不同處理次數對魚骨游離氨基含量的影響圖6 DHPM處理對魚骨游離氨基含量的影響Fig36 The effect of DHPM treatment on the calcium ion content of fish bone

3 結論

本文研究了DHPM處理對魚骨超微細化后理化性質及結構的影響。研究結果表明：隨著處理壓力和處理次數的增大，魚骨粒徑明顯減小。當DHPM處理壓力為100 MPa、處理次數為3～5次時，粒徑達到最小。掃描電鏡圖像顯示魚骨經DHPM處理后，其表面形貌發生改變，片狀結構被破壞形成小顆粒，繼而出現凝聚現象。DHPM處理能顯著改變魚骨的表面疏水性和鈣離子含量。經80 MPa的DHPM處理3次后，魚骨鈣離子含量達到最大值；經40 MPa的DHPM處理3次后，魚骨表面疏水性達到最大值。經不同處理壓力和次數的DHPM處理后，魚骨游離氨基含量均有所降低。當DHPM處理壓力為100 MPa、處理次數為5次時，游離氨基含量達到最低。上述結果表明DHPM處理能有效降低魚骨的粒度，影響魚骨的理化性質和結構。