蕨根米酒發酵條件優化及其抗氧化性研究

魏勁松，徐洲，黃憲龍，張超*

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039) 2(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓，644000)

蕨根為鳳尾蕨科植物蕨的根莖，又叫烏角、小角，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區[1]。蕨根富含淀粉、蛋白質、維生素及微量元素等營養成分，同時還含有黃酮類化合物等生物活性物質[2-3]，具有清熱解毒、健腎補脾的功效，還對防治中暑、鼻出血、牙痛和痢疾有特效[4-5]。蕨根是一種優良的藥食同源野生植物資源，目前對蕨根的研究主要集中在加工蕨根淀粉[6]，提取蕨根黃酮[3]等方面，鮮有將蕨根用于蕨根酒釀造的報道。在蕨根淀粉加工過程中，因黃酮類成分不易溶于水，現有蕨根淀粉的提取方法易造成蕨根黃酮的大量流失。

米酒是以糯米為主要原料，經糖化發酵而成[7]，米酒歷史悠久，口感良好，具有多種氨基酸、維生素等營養成分[8-9]。為了充分利用野生資源，提升米酒產品的營養價值，將蕨根與糯米混合發酵，釀造的蕨根米酒不僅可以有效利用蕨根淀粉的黃酮類物質，同時可解決單一蕨根酒口感欠協調的問題。

本研究在單因素試驗的基礎上對蕨根米酒發酵工藝參數進行響應面分析，同時對發酵成品進行體外抗氧化性研究，旨在提高蕨根資源的開發與附加值，為蕨根米酒的生產控制提供理論依據與基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕨根(60 ℃烘干，粉碎過40目篩)，宜賓志君蕨粉科技有限責任公司；糯米市售；安琪甜酒曲，安琪酵母股份有限公司；蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 、2,2-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙醇、磷酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、維生素C(VC)等，分析純。

T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；HH-W21-600S數顯電熱恒溫水溫箱，上海躍進醫療器械有限公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；ME204電子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；酒精計，河北武強同輝儀器廠；GTR21-1高速離心機，北京時代北利離心機有限公司；CNT95數顯糖度計，杭州陸恒生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

工藝要點：將糯米洗凈，浸泡24 h使其充分吸水，手捏無硬心；蒸煮好的糯米內無白心，熟而不爛；蕨根蒸煮30 min，讓蕨根淀粉糊化完全，將熟糯米和熟蕨根粉攤涼降至室溫混勻，加入甜酒曲攪拌均勻，在設定的溫度下進行糖化發酵；發酵結束后過濾得到蕨根米酒成品。

1.2.2 指標測定

總黃酮(以蘆丁計)測定：比色法[10]；殘糖(以葡萄糖計)測定：斐林試劑法[11]；酒精度測定：酒精計法[11]；總酸度測定：酸堿滴定法[11]；可溶性固形物含量測定：手持糖度計；菌落總數、大腸菌群、致病菌的檢測：采用《GB/T 4789.3—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》。

1.2.3 感官評定

選擇10名(男女各5名)經過感官評定培訓的食品專業學生組成評價小組，按照表1的感官評價標準對各樣品進行感官評分。

表1 蕨根米酒感官評價標準Table 1 Standards for sensory evaluation of ferm rice wine

1.2.4 發酵工藝條件優化和確定[7,12]

單因素試驗：選擇蕨根添加量(蕨根和糯米總量的百分比)20%、發酵溫度28 ℃、發酵時間5 d，考察不同安琪甜酒曲添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對蕨根米酒的影響；選擇酒曲添加量1.5%、發酵溫度28 ℃、發酵時間5 d，考察不同蕨根的添加量(10%、20%、30%、40%、50%)對蕨根米酒的影響；選擇蕨根添加量20%、安琪甜酒曲添加量1.5%、發酵時間5 d，考察不同發酵溫度(22、25、28、31、34 ℃)對蕨根米酒的影響；選擇蕨根添加量20%、安琪甜酒曲添加量1.5%、發酵溫度28 ℃，考察不同發酵時間(3、4、5、6、7 d)對蕨根米酒的影響。按照上述條件發酵完成后，以總黃酮含量和感官評分為評價指標對蕨根米酒的品質進行分析，確定單因素最佳條件。

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇安琪甜酒曲添加量(X1)、發酵溫度(X2)、發酵時間(X3)為響應變量，以總黃酮含量和感官評分為響應值進行3因素3水平響應面優化試驗，因素水平如表2所示。

表2 響應面試驗因素水平設計Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.2.5 體外抗氧化能力評價

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力

參照XIAO[13]等的方法，將0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5 mL的樣品分別加入4 mL DPPH甲醇溶液(0.1 mmol/L)，在室溫條件下黑暗反應30 min。以甲醇溶液為參比溶液，以VC為陽性對照，以去離子水代替樣品同體積反應混合液為空白對照，在517 nm下測定吸光度。DPPH自由基清除率按下式計算。

(1)

式中，A0為加同樣品等體積水后測定的吸光值；A1為加樣品后測定的吸光值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力

參照YE[14]的方法，將ABTS溶液(7 mmol/L)與等體積的過硫酸鉀溶液(2.5 mmol/L)混合，在室溫下將混合物在黑暗中放置16 h產生ABTS自由基陽離子(ABTS+)，用乙醇將ABTS+溶液稀釋成在734 nm處的吸光度為(0.7±0.01)的溶液。隨后將0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL樣品分別加入到5 mL上述稀釋液中，在室溫下反應5 min。以去離子水為參比溶液，以Vc為陽性對照，以去離子水代替樣品同體積反應混合液為空白對照，在734 nm處測定吸光度。ABTS自由基清除率按下式計算。

(2)

式中，A0為加同樣品等體積水后測定的吸光值；A1為加樣品后測定的吸光值。

1.2.5.3 還原力的測定

參考LIN[15]的方法測定還原力，將0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL的樣品分別加入到2.5 mL PBS(0.2 mol/L，pH值為 6.6)和2.5 mL鐵氰化鉀(10 g/L)的混合液中，50 ℃反應20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸(100 g/L)，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2 mL去離子水和0.5 mL三氯化鐵(10 g/L)，在室溫條件下反應10 min。以去離子水為參比溶液，以VC為陽性對照，在700 nm處測定吸光度。

1.2.5.4 羥基自由基清除能力

參考蔣增良[16]的方法，將0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的樣品分別加入到4 mL混合體系中(1.4 mL 6 mmol/L H2O2、0.6 mL 20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵)，在37 ℃的條件下反應20 min。以去離子水為參比溶液，以VC為陽性對照，以去離子水代替樣品同體積反應混合液為空白對照，在562 nm處測定吸光度。羥基自由基清除率按下式計算。

(3)

式中，A0為加同樣品等體積水后測定的吸光值；A1為加樣品后測定的吸光值

1.3 數據處理

采用Design-Expert 6.0.5軟件進行響應面試驗設計與結果分析，通過Excel 2003軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 蕨根米酒發酵工藝條件單因素試驗

2.1.1 蕨根添加量的確定

蕨根添加量主要影響蕨根米酒的總黃酮含量和成品的口感。由圖1可知，蕨根添加量較低時，蕨根米酒中總黃酮含量偏低且蕨根香氣偏淡，隨著蕨根添加量的增加，蕨根米酒的總黃酮含量呈遞增趨勢；當蕨根粉添加量達 50%時，蕨根米酒中雖然總黃酮含量最高，但所得的蕨根米酒蕨根味過濃、酒體稍渾、整體風味欠協調，導致感官評分較低。綜合考慮米酒感官效果和黃酮含量2個因素，確定蕨根添加量為 20%。

2.1.2 酒曲添加量的確定

圖1 蕨根添加量對蕨根米酒總黃酮含量和感官評分 的影響Fig.1 Influence of adding fern on total flavonoids and sensory evaluation of fern rice wine

酒曲是米酒發酵的動力，其添加量對米酒的品質有著較大的影響。酒曲添加量太低，淀粉的糖化效率降低，發酵進程減慢，導致米酒酒精度較低且風味寡淡有異味；酒曲添加量過高，米酒發酵速度過快，不利于風味的形成[17]。由圖2可知，隨著酒曲添加量的增加，蕨根米酒中總黃酮含量逐漸升高，當酒曲添加量大于1.5%時，米酒中總黃酮含量升高緩慢，可能是由于霉菌產生的一些酶破壞了蕨根細胞結構使黃酮含量有所升高。隨酒曲添加量的增加蕨根米酒發酵加快、風味得到改善，且在酒曲添加量為1.5%時蕨根米酒風味最佳、感官評分最高；當酒曲添加量大于1.5%時，蕨根米酒中酸味和澀味較明顯，風味較差，感官評分降低。綜合考慮，選擇酒曲添加量為1.5%較為適宜。

圖2 酒曲添加量對蕨根米酒總黃酮含量和感官評分 的影響Fig.2 Influence of adding Jiuqu on total flavonoids and sensory evaluation of fern rice wine

2.1.3 發酵溫度的確定

溫度對微生物的生長和蕨根米酒品質有著較大的影響。溫度較低時，酒曲中的霉菌生長較慢，延長發酵前糖化階段，容易引起雜菌污染；此外酵母菌代謝活動較弱，發酵速率較低，不利于優勢菌群的形成；發酵溫度過高時，霉菌快速生長，淀粉糖化加快，導致蕨根米酒糖濃度較高影響酵母發酵；此外發酵溫度過高，酵母生長加快，生成較多的代謝產物，導致蕨根米酒口感欠佳。由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，蕨根米酒總黃酮含量和感官評分先增加后降低，當發酵溫度為31 ℃時，蕨根米酒的總黃酮含量和感官評分均達到最高值，因此發酵溫度選擇31 ℃為宜。

圖3 發酵溫度對蕨根米酒總黃酮含量和感官評分 的影響Fig.3 Influence of fermentation temperature on total flavonoids and sensory evaluation of fern rice wine

2.1.4 發酵時間的確定

發酵時間過短，米酒中糖度較高，并且岀汁量少，酒香味不明顯。由圖4可知，延長發酵時間可以增加蕨根米酒中總黃酮的含量，可能是由于發酵時間的延長增加了蕨根米酒中的酒精度，從而增加蕨根黃酮的溶解。在發酵時間為5 d時，蕨根米酒的風味最佳，感官評分最高；雖然延長發酵時間可以增加蕨根米酒中總黃酮含量，但會導致蕨根米酒酒精味突出，影響其整體風味，故選擇最佳發酵時間為5 d。

圖4 發酵時間對蕨根米酒總黃酮含量和感官評分 的影響Fig.4 Influence of fermentation time on total flavonoids and sensory evaluation of fern rice wine

2.2 響應面法對蕨根米酒工藝優化

2.2.1 模型的建立及其顯著性驗證

根據單因素試驗的結果，確定蕨根添加量為20%，利用Design-Expert 6.0.5軟件，通過box-behnken試驗設計原理進行三因素三水平試驗，以總黃酮含量和感官評分為響應值進行響應面試驗，其因素水平設計與響應值結果如表3所示。

以蕨根米酒總黃酮含量(Y1)和感官評分(Y2)為響應值，建立蕨根米酒發酵工藝參數回歸模型。得到模型的回歸方程為：

表3 響應面試驗設計方案及結果Table 3 Results of Box-Behnken design

對模型進行方差分析，結果如表4所示，建立的模型方程Y1和Y2極顯著(p<0.000 1和p=0.000 4)；失擬項在0.05水平上均不顯著(p>0.05和p>0.05)，表明試驗結果和數學模型擬合良好，模型可用；擬合模型的相關系數R2分別為0.974 4和0.959 5，表明模型方程的擬合程度較好；本試驗2個模型CV(變異系數)分別為2.86和1.37，在可接受的范圍內，說明試驗結果可靠。

2.2.2 驗證試驗結果

經軟件Design-Expert 6.0.5分析得到：以總黃酮含量為響應值的最佳發酵參數為酒曲添加量1.52%、發酵溫度28.17 ℃、發酵時間5.46 d，此時蕨根米酒總黃酮含量預測值為44.19 mg/L。根據實際情況選擇酒曲添加量為1.5%、發酵溫度為28 ℃、發酵時間為5.5 d的條件，在該條件下進行3次平行試驗，得到蕨根米酒總黃酮含量為43.32 mg/L，與預測值的相對誤差為1.97%，進一步驗證模型方程Y1的實用性。

以感官評分為響應值的最佳發酵參數為酒曲添加量1.61%、發酵溫度30.78 ℃、發酵時間5.13 d，此時蕨根米酒感官評分預測值為84.29。根據實際情況選擇酒曲添加量為1.6%、發酵溫度為31 ℃、發酵時間為5 d的條件，在該條件下進行3次平行試驗，得到感官評分為83，與預測值的相對誤差為1.53%，表明預測值與實際值相差不大，說明模型方程Y2能較好地反映各因素與感官評分的關系。

綜上不同發酵工藝參數對蕨根米酒總黃酮含量和感官評分的影響，經軟件對發酵參數進行分析后得到最佳工藝條件。酒曲添加量為1.57%、發酵溫度為27.94 ℃、發酵時間為5.30 d，此時蕨根米酒總黃酮含量和感官評分預測值分別為44.03和84.18 mg/L。根據實際情況選擇酒曲添加量為1.6%、發酵溫度為28 ℃、發酵時間為5.5 d的條件，在此條件下進行3次平行實驗后得到總黃酮含量為43.88 mg/L，感官評分為85，與預測值吻合，因此響應面優化蕨根米酒發酵工藝參數準確可靠。

表4 總黃酮含量和感官評分回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in the regression model for sensory score and total flavonoids

2.3 產品質量指標

由表5可知，蕨根米酒的酒精度為12.65%，殘糖含量為25.03 g/L，總酸含量為3.61 g/L，符合傳統型半干黃酒理化要求。菌落總數小于34 CFU/mL，大腸桿菌和致病菌均未檢出，符合國家標準。

表5 蕨根米酒產品質量分析Table 5 Analysis of product quality of fern rice wine

2.4 蕨根米酒抗氧體外化活性評估

不同的抗氧化性能評估其反應物之間的機制存在著差異，因此單一的抗氧化性能的測定難以反映抗氧化能力。本研究通過4種方法對蕨根米酒體外抗氧化能力進行評估，結果如圖5所示。

清除DPPH自由基是常見的抗氧化評價方法[18]。由如圖5-a所示，蕨根米酒的DPPH自由基清除能力高于米酒，且隨著樣品體積的增加，其DPPH自由基清除率逐漸增加，表現出一定的劑量依賴性。在試驗的體積范圍內，蕨根米酒的DPPH自由基清除率從12.12%增加到62.18%，米酒的DPPH自由基清除率從10.62%增至50.31%。通過計算得到，蕨根米酒的IC50為0.038 mgVC/mL，米酒的IC50為0.022 mgVC/mL，兩者的差異顯著(p<0.05)。可能是因為蕨根中含有酚類物質和黃酮類化合物，在發酵過程進入到米酒中，表現出一定的抗氧化活性。SINGH[19]等研究表明酚類和黃酮類化合物參與自由基鏈的終止反應，從而表現出自由基清除能力。

a-DPPH自由基清除能力;b-ABTS自由基清除能力;c-還原力;d-羥基自由基清除能力圖5 蕨根米酒抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of fern rice wine

圖5-b顯示的是蕨根米酒對ABTS自由基清除能力的影響。在試驗濃度范圍內，蕨根米酒ABTS自由基清除能力略大于米酒；當樣品加入量在0.01～0.1mL時，蕨根米酒ABTS自由基清除能力大于Vc試驗組；當樣品加入量大于0.2 mL后，蕨根米酒、米酒和Vc對照組的ABTS自由基清除能力均逐漸趨于穩定且蕨根米酒、米酒ABTS自由基清除能力低于VC試驗組；當樣品加入量為0.4 mL時，蕨根米酒、米酒和VC對照組的ABTS自由基清除能力分別為95.41%、96.13%和99.25%；計算得知蕨根米酒和米酒的IC50分別為0.779 mgVC/mL、0.569 mgVC/mL，兩者差異顯著(p<0.05)。從IC50可以看出，蕨根米酒ABTS自由基清除能力大于DPPH自由基清除能力，這可能是由于抗氧化劑對不同的自由基的反應速率不一樣，HUANG等[20]研究報道許多抗氧化劑與脂質過氧化反應產生的過氧自由基反應迅速，而與DPPH自由基反應較慢。

由圖5-c可知，蕨根米酒還原力隨樣品加入量的增加而增加，也表現出劑量依賴性，蕨根米酒還原力稍高于米酒，遠低于VC對照組。在實驗樣品加入量范圍內，蕨根米酒的還原力從0.123增加到0.692，米酒的還原力從0.110增至0.623。MARAZZA[21]，LEE等[22]研究表明還原力與多酚類物質抗氧化活性密切相關，還原力也與存在還原酮的供氫能力關系密切。由此可知，蕨根米酒在發酵過程中可能形成了還原劑而提高其還原力；此外，細胞內抗氧化劑，生物體的肽和它們的供氫能力也有助于還原力的增加[15,22]。

在活性氧中，羥自由基是最活潑的自由基，能夠誘導生物分子氧化損傷[23]。由圖5-d所示，蕨根米酒的羥基自由基清除能力隨樣品加入量的增加而增加，同時表現出劑量依賴性，蕨根米酒羥基自由基清除能力高于米酒，低于VC對照組。蕨根米酒和米酒的IC50分別為2.335 mgVC/mL、1.822 mgVC/mL，兩者差異顯著(p<0.05)。蕨根米酒表現出較強的羥基自由基清除能力，高于DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，這可能是由于在蕨根米酒中存在著對羥基自由基清除較強的活性物質。

3 結論

本研究以糯米和蕨根為原料制得蕨根米酒，通過單因素和Box-Behnken設計試驗，采用響應面分析法優化蕨根米酒發酵工藝條件，得到優化的工藝條件為：蕨根粉添加量為20%、酒曲添加量為1.6%、發酵溫度為28 ℃、發酵時間為5.5 d，在此條件下得到蕨根米酒總黃酮含量43.88 mg/L，感官評分85，酒精度為12.65%、殘糖含量25.03 g/L、總酸含量3.61 g/L、可溶性固形物含量8.89%，菌落總數、大腸桿菌、致病菌總數均符合國家標準。體外抗氧化活性研究表明：蕨根米酒的DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力、羥基自由基清除率在實驗體積的范圍內均表現出劑量依賴性，而且蕨根米酒的4種抗氧化能力都高于米酒。從IC50可以看出，蕨根米酒的自由基清除能力順序是：羥基自由基清除率(2.335 mgVC/mL)>ABTS自由基清除率(0.779 mgVC/mL)>DPPH自由基清除率(0.038 mgVC/mL)。蕨根米酒是一種富含黃酮類物質、有機酸、氨基酸等多種成分，具有一定養生功能的飲品。