乳酸菌發酵對荔枝汁中γ-氨基丁酸含量的影響

盧嘉懿，張馳，李汴生,2*，阮征

1(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510640) 2(廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣東 廣州，510640)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是目前研究較多的一種非蛋白氨基酸[1-2]，是中樞神經系統的主要抑制性神經遞質,有降壓、利尿、鎮靜等生理功能[3]，對神經系統疾病如癲癇、帕金森綜合征、精神分裂、失眠、抑郁等有一定療效[4]。

2017年中國生物發酵產業協會發布的《T/CBFIA08003—2017食用植物酵素》標準要求液態食用植物酵素中GABA含量不低于0.03mg/kg。

GABA在谷物、乳制品、酒類、泡菜制品等方面的研究應用已較為深入。果蔬汁經發酵后，GABA含量顯著增加，乳酸菌發酵的西紅柿汁中，GABA含量顯著高于未發酵西紅柿汁，且發酵結束后GABA含量仍在增加[5]；椰棗泥[6]、馬齒莧[7]、葛根汁[8]等經發酵后，GABA含量亦有所提高。但目前仍缺乏對發酵果蔬汁中GABA產生來源的探究。

微生物主要利用GABA旁路來合成GABA(圖1)。葡萄糖通過檸檬酸循環(TCA循環)代謝為α-酮戊二酸，并通過谷氨酸脫氫酶轉化為谷氨酸。谷氨酸鹽被谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase,GAD)分解成GABA。GAD在動物、植物和微生物中均有存在。GAD所催化的L-谷氨酸(L-glutamicacid，L-Glu)脫羧生成GABA的反應，是生物GABA合成的關鍵，絕大多數生物合成GABA的研究都依賴該途徑。

圖1 GABA代謝途徑 Fig.1 The metabolic pathway of GABA

除了L-Glu，谷氨酸鈉(sodiumglutamate,MSG)也可作為GAD的底物。此外，另一種腐胺途徑(見圖1)發現較晚,代謝途徑復雜,有毒且價格昂貴，應用極少，難以像葡萄糖、L-Glu和谷氨酸鈉等物質作為前體直接添加在發酵液或轉化液中用于GABA的生物合成。

在乳酸菌發酵果蔬汁中，因果蔬原料本身特性差異(例如GAD活性)，菌種發酵代謝特性差異以及添加物等都會影響產品中的GABA含量。本研究選取常用于發酵的雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、發酵桿菌和植物乳桿菌[9]，以荔枝、龍眼、青瓜、臍橙、蘋果、梨為對象，分析不同菌種和不同果蔬原料中GABA產生的異同，并探究MSG、葡萄糖和L-Glu這3種常用底物在發酵果蔬汁中的利用情況。最后，將菌液和果汁分開單獨處理并與發酵果汁做對比，以探究發酵果蔬汁中GABA的產生來源，為生產富含GABA的膳食飲品提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售青瓜、臍橙、紅富士蘋果、蜜梨、石硤龍眼、妃子笑荔枝，選擇成熟度合適、無明顯缺陷的果品；植物乳桿菌LP115(Lactobacillusplantarum)，雙歧桿菌 LYD 10DCU-S(Bifidobacterium)，嗜酸乳桿菌LYO 10DCU-S(Lactobacillusacidophilus)，副干酪乳桿菌 LYO 50DCU-NM(Lactobacillusparmesei)，杜邦·丹尼斯克公司提供；γ-氨基丁酸標準品，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療機械廠；SPX-150D-Z生化(恒溫)培養箱，上海博訊實驗有限公司醫療設備廠；752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；HR1895榨汁機，飛利浦(中國)投資有限公司；Thermo U-3000高效液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

果蔬汁制備：臍橙、龍眼、荔枝洗凈并去皮去核，蘋果、梨、青瓜洗凈，用榨汁機分別榨汁，過100目紗布；每150 mL分裝于250 mL潔凈錐形瓶中，使用硅膠塞密封，將果汁迅速加熱至80 ℃，水浴保溫10 min后迅速冷卻至40 ℃，準備接種。

不同菌種發酵差異實驗：荔枝汁制備完畢后分別接種植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌單一菌種，4種菌兩兩之間1∶1復配成混合菌種，和4種菌1∶1∶1∶1復配成混合菌種，使得初始活菌數達7.0 lg(CFU/mL)左右，采用37 ℃恒溫箱靜置發酵24 h，取0 h和24 h的樣品進行指標測定。

不同果蔬汁發酵差異實驗：6種果蔬汁接種4%的植物乳桿菌菌液，初始活菌數達7.0 lg(CFU/mL)，37 ℃恒溫箱靜置發酵24 h，取0 h和24 h的樣品進行指標測定。

不同添加物差異實驗：荔枝汁制備完畢后分別加入質量分數為1%、2%、3%的谷氨酸鈉(MSG)、葡萄糖(Glucose)或L-谷氨酸(L-Glu)，并接種4%的植物乳桿菌，37 ℃恒溫箱靜置發酵24 h，取0 h和24 h的樣品進行指標測定。

發酵果汁中產生GABA機理探究：荔枝清汁(榨汁后過100 目紗布)接種4%的植物乳桿菌于37 ℃發酵24 h；MRS液體培養基接種4%的植物乳桿菌，后用乳酸調pH值至3.32(與發酵結束后的荔枝汁相同)的荔枝汁于37 ℃放置24 h。取荔枝濁汁(榨汁后不過濾)重復上述制樣步驟。

1.3.2 指標測定

活菌數：參考《GB 478935—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》，采用稀釋平板計數法進行測定；pH值：參考《GB 10468—1989水果和蔬菜產品pH值的測定方法》，采用電位差法；GAD粗酶液的制備參考文獻[10]；GAD活性測定參考文獻[11]。

1.3.3 高效液相色譜法測定GABA含量

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，樣品處理及色譜條件參考文獻[12]，如圖2，圖3所示。

圖2 GABA標準品色譜圖Fig.2 The chromatogram of GABA standard

圖3 GABA標準溶液的工作曲線Fig.3 The standard curve of GABA solution

1.3.4 數據分析

采用Origin 9.0、SPSS 20.0和Excel 2007軟件進行處理和分析。若無特別標明，每個數據均平行測定3次，結果表示為均值±標準偏差。采用Duncan新復極差分析法，取95%置信區間(p<0.05)；采用Pearson相關性分析，p<0.05為顯著相關，p<0.01為極顯著相關。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種對荔枝果汁中GABA含量的影響

植物乳桿菌是頻繁被報道的高產GABA的菌種[13]，常在泡菜[14]、米酒[15]等傳統發酵果蔬、谷物制品中分離及應用。副干酪乳桿菌也有在發酵乳制品、發酵肉制品中分離及應用于產生GABA的研究[16-17]。嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌也是常用于發酵果蔬汁的菌種，但與GABA相關方面的研究很少。不同菌種發酵產生GABA的能力差異值得深入研究。

荔枝是典型的富含GABA的水果，以荔枝為對象，探究不同菌種發酵對荔枝汁中GABA含量的影響。如圖4所示，各菌種在荔枝汁中增殖情況差異不大，發酵24 h后活菌數均能增加到10.0 lg(CFU/mL)左右，但不同菌種發酵的荔枝汁中GABA含量差異較大，其中植物乳桿菌發酵荔枝汁中GABA含量最高。KIM等[3]在短乳桿菌發酵的黑樹莓汁和KO等[19]在黑豆乳中的研究都表明菌種發酵產生GABA與其代謝增殖能力差異無顯著相關性，而與菌種中GAD活性相關。

不同菌種發酵荔枝汁中GABA含量增加情況與各菌種的酸化能力顯著相關(p<0.05)。各菌種在荔枝汁中酸化能力不同，其中植物乳桿菌酸化能力最強，能將荔枝汁的pH值從初始的6.65降3.32。荔枝果汁中初始GABA含量為1.33 mg/kg,植物乳桿菌發酵后的荔枝果汁中GABA含量最高(1.87 mg/kg)，其次是嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌。研究表明，當初始發酵pH值為3.5～5.5時，GABA的合成差異不顯著，當初始發酵pH值為6.0時，GABA產量顯著減少[3]。由于發酵時乳酸等有機酸的積累，使pH值下降并激活GAD開始生產GABA[20]，而厭氧條件亦可促進GAD的表達，有利于GABA的合成。而負責分解GABA的Gab T和Gab D的最適pH值約為 9.0，因此乳酸菌發酵產生的酸性環境除了可以促進GABA合成外還可抑制GABA的分解代謝[20]。

圖4 不同菌種發酵荔枝汁中的GABA含量Fig.4 The content of GABA in lychee juices fermented by different starters

將4種菌種進行兩兩復配研究，因菌種之間的協同作用，菌種復配發酵時，荔枝汁中活菌數、產酸量和GABA含量均比菌種單一發酵有不同程度的提高。

結合圖4和圖5，單一菌種發酵時產生的GABA的能力基本決定了復配時菌種產生GABA的能力，有植物乳桿菌參與的復配方案所發酵果汁中的GABA含量均排在前列，其中植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌1∶1復配發酵時表現最優。與當4種菌1∶1∶1∶1混合發酵時，GABA含量與植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌1∶1發酵無顯著差異，說明4種菌混合發酵時，植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌在荔枝汁中起主導作用。菌種復配發酵實驗規律也與單一發酵時結果相符合，不同復配方案發酵荔枝汁中GABA增加情況與菌種產酸能力呈正相關(p<0.05)。菌種產酸能力越強，其創造的酸性條件越能刺激組織產生GABA。

圖5 不同菌種復配發酵荔枝汁中的GABA含量Fig.5 The content of GABA in lychee juices fermented by different combinations of starters

2.2 不同果蔬汁發酵前后GABA含量的變化

用前文所述在荔枝果汁中發酵表現最優的植物乳桿菌發酵不同的果蔬汁。如圖6所示，不同果蔬汁中初始GABA含量差異較大，蘋果汁和梨汁中GABA含量只有0.01 mg/kg左右，而荔枝汁和龍眼汁中含量最高，分別為1.33 mg/kg和1.27 mg/kg。雖然蘋果汁和梨汁初始GABA含量沒有達到《T/CBFIA 08003—2017食用植物酵素》標準中液態食用植物酵素中GABA含量不低于0.03 mg/kg的要求，但經植物乳桿菌發酵后蘋果汁和梨汁中的GABA含量增加到0.11 mg/kg和0.14 mg/kg，遠超過了標準。

圖6 不同果蔬汁發酵前后GABA含量變化Fig.6 The content of GABA in different juices before and after fermentation

發酵后各果蔬汁中GABA含量增加程度不一，增加量與果蔬汁中初始GAD活性顯著相關(p<0.05)，蘋果汁、梨汁、青瓜汁和橙汁中GAD活性較低，發酵后增量較不顯著，而龍眼汁、荔枝汁中GAD活性高，發酵后GABA含量增加明顯。

2.3 添加物對發酵荔枝汁中GABA含量的影響

葡萄糖(glucose)、谷氨酸鈉(MSG)和L-谷氨酸(L-Glu)沒有毒性且相對廉價易得，因而不少研究將其作為前體，直接添加在發酵液或轉化液以促進GABA的合成。例如乳酸菌在棗渣中發酵時添加谷氨酸，轉化率可達80%～90%[21]；在牛奶中加入谷氨酸可使GABA產量提高20%[22]；加入糖、MSG的黑豆乳中GABA含量都有不同程度的提高。如圖1和圖7所示，MSG、glucose、L-Glu都是GABA代謝路徑中的底物，但在植物乳桿菌發酵荔枝汁中，這3種底物的轉化規律不盡相同。

圖7中可看出，植物乳桿菌在荔枝汁中對MSG的利用率最高，相同添加量下，3種物質中添加MSG的發酵荔枝汁中的GABA含量最高。但隨著MSG添加量的增加，果汁中GABA含量反而有下降的趨勢，這有可能是因底物的濃度的增加而觸發了逆反應。在發芽糙米的GABA富集上也出現了相似的情況，當MSG含量大于2 mg/kg時，GABA含量隨MSG濃度升高而下降[23]。相對于MSG和L-Glu，葡萄糖的添加對發酵荔枝汁中的GABA產量影響較小，這與荔枝汁中達到17.82 g/100g的總糖含量相關。在發酵果蔬汁中添加底物不僅要考慮對GABA含量的影響，還要考慮添加物對健康、果汁感官及消費者接受度等因素[3]，例如有研究表明在黑豆乳中加入5%的MSG后風味變得難以接受[19]。

LJ-荔枝汁；無添加LF-未添加前體物質的發酵荔枝汁圖7 不同添加物對荔枝果汁中GABA含量的影響Fig.7 The content of GABA in fermented lychee juices after addry glncose,MSG and L-Glu

2.4 發酵荔枝汁中產GABA機理探究

植物乳桿菌發酵荔枝汁中增加的GABA包括兩種來源：一是因荔枝組織對外界條件(如破碎、溫度、低氧、酸度)應激代謝生成；二是植物乳桿菌在荔枝汁中代謝產生。為了探究植物乳桿菌發酵荔枝汁中GABA增加的機理，將菌液和汁分開處理并與發酵荔枝汁對比。荔枝汁接種4%植物乳桿菌并于37 ℃發酵24 h后GABA含量由1.33 mg/kg增加至1.87 mg/kg;經過調酸酸化的荔枝汁在37 ℃下儲藏24 h后，GABA含量從1.33 mg/kg增加到1.38 mg/kg。添加了4%植物乳桿菌的MRS液體培養基(即圖8中的純菌液)中的GABA含量則由0 mg/kg增加到0.18 mg/kg。

圖8 發酵荔枝汁中GABA含量構成圖Fig.8 The composition of GABA content in fermented lychee juice

可以發現純菌液和酸化荔枝汁單獨放置后兩者共同增加的GABA含量仍顯著低于發酵荔枝汁中的增加量。一是因為發酵荔枝汁中由植物乳桿菌創造的外界條件(如發酵產生的比人為添加乳酸酸化更復雜穩定的有機酸體系)更能促使荔枝組織產生GABA；二是因為植物乳桿菌在荔枝汁中有更充足的營養物質，比在MRS培養基中發酵產生更多GABA；三是因為發酵荔枝汁中因植物乳桿菌作用使得荔枝組織細胞通透性增強，使得原有荔枝汁中的GABA和因外界刺激而新產生的GABA更好地溶出，例如在乳酸菌發酵棗渣的制備中，為提高GABA的含量，對棗渣的前處理如添加淀粉酶、纖維素酶和果膠酶是必不可少的[21]，除了能使菌種更好地利用營養物質之外，也能使組織中產生的GABA更好地溶出。

酸化的荔枝濁汁放置后GABA增加量高于酸化后荔枝清汁GABA的增加量，這是因荔枝濁汁中含有更多的荔枝組織和其內GAD活性導致的。因此濁汁發酵后GABA增量顯著高于清汁發酵后GABA的增量。

3 結論

乳酸菌發酵能顯著提高果蔬汁中GABA含量。不同果蔬組織中原有GAD活性越高，發酵后GABA增量越多。不同發酵菌種酸化能力越強，發酵果汁中GABA增量越多。與葡萄糖和L-Glu相比，植物乳桿菌在荔枝汁中對MSG的利用率最高，但隨著MSG添加量的增加，果汁中GABA含量反而有下降的趨勢，而葡萄糖的添加對發酵荔枝汁中的GABA含量幾乎沒有影響。植物乳桿菌不僅能在荔枝中發酵產生GABA，其創造的酸性低氧條件能刺激荔枝組織代謝產生GABA，并且能使荔枝組織細胞通透性增強，讓荔枝汁中原有的GABA和因外界刺激而使荔枝組織新產生的GABA更好地溶出。通過乳酸菌發酵果蔬汁這一系列產品來滿足消費者對富含GABA的膳食的需求是可靠并具有前景的。