基于高通量測序技術解析高溫大曲和中高溫大曲的真菌群落結構

李靜心，王艷麗，何宏魁，劉國英，李曉歡，陳斌，吳翠芳，王錄

(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州,236820)

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，具有悠久的生產歷史，并通過獨特的發酵工藝生產，其中濃香型白酒具有“綿柔甘洌、芳香濃郁、香味協調、尾凈余長、入口甜、落口綿”的酒體風格，在我國白酒行業中占據主導地位[1]。大曲作為釀酒過程中的糖化劑和發酵劑在濃香型白酒的釀造過程中起著糖化、生香、發酵、提供菌源的作用，被人們評價“曲為酒之骨”。大曲中含有豐富的微生物種群，其中霉菌可以產生淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等豐富的酶系，酵母則具有酒精發酵能力及產酯能力，對白酒中酒精及香味物質的產生起著十分重要的作用[2]。

對大曲中真菌微生物的研究最早是通過傳統的分離培養方法，羅惠波等[3]對瀘州老窖大曲中的真菌進行分離培養發現，大曲內存在大量的曲霉屬、根毛霉屬、橫梗霉屬等霉菌類群以及釀酒酵母、德巴利氏酵母屬、異常威克漢姆酵母、鎖擲酵母屬等酵母菌類群。劉婷婷等[4]從白云邊大曲及小麥原料中分離得到壯觀擬青霉(Paecilomycesspectabilis)，傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)和微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)。然而，傳統的分離培養方法受到培養基的選擇性、微生物的生長特性等因素影響[5]，很難直接展現大曲中微生物的真實群落結構。隨著分子生物學技術的發展，針對真菌內轉錄間隔區(internaltranscribedspacer，ITS)研究技術的出現，大大提升了大曲微生物的研究效率。WANG等[6]借助PCR-DGGE技術分析了不同大曲中微生物組成的差異，結果表明Saccharomycopsisfibuligera和Pichiaanomal是大曲中主要的酵母類群，Aspergillusoryzae和Absidiablakesleeana是大曲中主要的霉菌類群。喬曉梅等[7]利用高通量測序技術對清香型大曲真菌群落結構進行分析，結果表明傘枝梨頭霉(Lichtheimiacorymbifera)、米根霉(Rhizopusoryzae)、庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)和扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)是清香型大曲中的優勢菌。胡佳音等[8]對清香、醬香、濃香3種大曲真菌進行多樣性分析，結果表明扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)和傘枝橫梗霉(Lichtheimiacorymbifera)是清香型大曲的主要真菌，謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)、嗜熱子囊菌(Thermomyceslanugin)是濃香型大曲主要真菌，謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)和嗜熱子囊菌(Thermomyceslanuginosus)是醬香型大曲的主要真菌。

該研究擬通過高通量測序技術，對白酒釀造所需高溫大曲和中高溫大曲進行研究，分析大曲中的主要真菌微生物構成，為優化濃香型白酒大曲生產工藝和提升原酒品質提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

大曲樣品均采集自安徽省北部某知名白酒生產企業，樣品為出房高溫大曲和中高溫大曲，每種大曲采集5個樣品，置于-80℃保存。樣品編號及分組如下：CZ1、CZ2、CZ3、CZ4、CZ5(中高溫大曲)；CG1、CG2、CG3、CG4、CG5(高溫大曲)。

1.2 試劑與儀器

高級化學發光成像工作站，美國UVP；G-26C高速冷凍離心機，德國Sartorius；DYY-4C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；MaestroNano微量分光光度計，美國MaestroGen。

DNeasy PowerSoil Kit土壤DNA提取試劑盒，美國QIAGEN；50×TAE溶液，生工生物工程(上海)股份有限公司；Agarose M，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 DNA提取

分別稱取0.25 g高溫大曲和中高溫大曲樣品置于2.0 mL離心管中，參照DNeasy PowerSoil Kit提取大曲微生物的基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的完整性，MaestroNano微量分光光度計測定DNA濃度及純度。將符合測序要求的DNA -80℃保存。

1.3.2 高通量測序

利用深圳華大基因科技有限公司Illumina HiSeq 2500 2×250 bp測序平臺對真菌ITS1進行高通量測序。

1.3.3 數據分析

根據華大基因提供的高通量測序下機數據(raw data)，利用mothur軟件進行拼接、過濾、嵌合體去除、OTU劃分和物種注釋[9]，注釋采用UNITE ITS數據庫(Version No. 7.2, https://unite.ut.ee)，置信度閾值設置為0.8。同時使用mothur軟件對各樣品的α多樣性指數等指標進行計算。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果及真菌多樣性分析

大曲樣品提取基因組DNA后，對ITS1區進行高通量測序，10個樣品共得到1 665 390條原始序列，質控后得到了1 549 585條優質序列，平均長度304 bp。將所有的序列按97% 的一致性將序列聚類成OTU，共得到200個OTU。使用UNITE真菌ITS數據庫對每個OTU的代表序列進行物種注釋，共注釋得到3個門、16個綱、31個目、51個科、73個屬和96個種水平的真核微生物。

對測序序列進行隨機二次抽樣，預測每個樣品預期的OTU總數和相對豐度繪制稀釋曲線[10](圖1)。結果表明，隨著測序序列的增加，10個樣品的稀釋曲線均趨于平滑，觀測到的OTU數量趨于飽和，說明本試驗的測序深度覆蓋了絕大多數真菌微生物，本次測序結果能夠真實反映中高溫大曲和高溫大曲真菌的群落結構和多樣性。

圖1 大曲真菌OTU數稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of OTUs in Daqu

利用mothur軟件計算各樣品的α多樣性指數(表1)。

表1 大曲的真菌多樣性指數Table 1 Fungus diversity index of Daqu

注：Coverage-樣品的序列覆蓋度；OTU-樣品的OTU數目；Chao指數和Ace指數-反映樣品的群落豐富度；Shannon指數和Simpson指數-反映樣品的群落多樣性。

結果表明，所有樣品的序列覆蓋度(coverage)均大于0.999，再次證明本次測序的結果能夠真實的反映所有樣本真菌微生物的菌群結構。經分析，中高溫大曲的OTU數量(81.80±5.14)多于高溫大曲的OTU數量(61.60±12.02)，但差異不顯著(p≥0.05)；中高溫大曲的Chao指數(91.21±5.70)高于高溫大曲的Chao指數(78.50±12.64)，但差異不顯著(p≥0.05)，說明中高溫大曲和高溫大曲都具有較多的真菌種類，中高溫大曲中的真菌種類稍多于高溫大曲；中高溫大曲的Shannon指數(1.537±0.151)高于高溫大曲的Shannon指數(0.693±0.178)，且差異極顯著(p≤0.01)，說明中高溫大曲的真菌群落多樣性高于高溫大曲。綜上所述，中高溫大曲和高溫大曲在真菌群落豐富度上差異較小，但中高溫大曲的真菌群落多樣性遠高于高溫大曲。

2.2 大曲真菌群落組成分析

2.2.1 屬水平分析

使用mothur軟件按照97%的相似度對測序結果進行OTU劃分，采用UNITE ITS數據庫(Version No. 7.2)對每個OTU進行classify，中高溫大曲和高溫大曲共得到73個屬的真菌，其中核心真菌微生物(含量>1%)共有9個屬(表2)，分別是Aspergillus(曲霉屬)、Thermomyces(嗜熱真菌屬)、Wickerhamomyces(威克漢姆酵母屬)、Issatchenkia(伊薩酵母屬)、Candida(假絲酵母屬)、Saccharomycopsis(復膜孢酵母屬)、Trichosporon(毛孢子菌屬)、Wallemia屬和Rhizomucor(根毛霉屬)，根據其在每個樣品所占比例繪制柱狀分布圖(圖2)。

表2 大曲真菌屬水平百分比組成 單位：%

結果表明，高溫大曲的優勢真菌為Aspergillus((12.70±3.65)%)和Thermomyces((80.50±6.89)%)，約占高溫大曲真菌的78.78%～98.80%；中高溫大曲的優勢真菌為Aspergillus((24.85±3.76)%)、Issatchenkia((38.22±8.88)%)、Saccharomycopsis((25.66±5.06)%)，約占中高溫大曲真菌的80.67%～94.65%。

圖2 大曲真菌屬水平微生物菌群Fig.2 Microbial community at genus levels in Daqu

2.2.2 種水平分析

在種水平對大曲真菌進行分類分析，共得到了96個種，其中優勢真菌(>1%)有10個種(表3)，分別是Aspergillusoryzae(米曲霉)、Aspergillusintermedius、Thermomyceslanuginosus(疏綿狀嗜熱絲孢菌)、Wickerhamomycesanomalus(異常威克漢姆酵母)、Issatchenkiaorientalis(東方伊薩酵母)、Candidatropicalis(熱帶假絲酵母)、Saccharomycopsisfibuligera(扣囊復膜酵母)、Trichosporonasahii(阿氏絲孢酵母)、Wallemiasp.和Rhizomucorpusillus(微小根毛霉)，根據其在每個樣品所占比例繪制柱狀分布圖(圖3)。

結果表明，高溫大曲的優勢真菌為2種霉菌Thermomyceslanuginosus((80.49±6.90)%)和Aspergillusintermedius((10.95±3.53)%)，約占高溫大曲真菌的74.46%～98.58%；中高溫大曲的優勢真菌為2種酵母菌Issatchenkiaorientalis((38.22±8.88)%)和Saccharomycopsisfibuligera((25.66±5.06)%)，以及1種霉菌Aspergillusoryzae((21.40±3.59)%)，約占大曲真菌的70.39%～93.95%。

對高溫大曲和中高溫大曲優勢真菌中霉菌與酵母菌的相對豐度進行分析，并繪制相對豐度柱形圖(圖4)。結果表明，高溫大曲的霉菌含量較高，約占真菌的78.65%～98.73%，酵母菌含量較低，僅有0.29%～3.84%；中高溫大曲的酵母菌所占比例約為66.21%～86.02%，霉菌所占比例稍低，約為12.46%～33.04%(表4)。霉菌是構成高溫大曲的主要真菌，而酵母菌是構成中高溫大曲的主要真菌。

表3 大曲真菌種水平百分比組成 單位：%

圖3 大曲真菌種水平微生物菌群Fig.3 Microbial community at species levels in Daqu

圖4 霉菌與酵母菌含量柱形圖Fig.4 Contents of moulds and yeasts in Daqu

表4 大曲霉菌與酵母菌百分比組成單位：%

2.3 物種差異分析

根據樣品中不同種水平真菌含量的相對豐度，采用Bray-Curtis算法計算樣本間距離矩陣，通過PCoA(principal coordinates analysis)分析高溫大曲和中高溫大曲群體間的差異。兩組大曲真菌群落結構PCoA分析結果如圖5所示，第一主成分PC1的貢獻率為79.55%，權重最大，第二主成分PC2的貢獻率為7.25%，累計貢獻率為86.80%，說明兩組間差異具有統計學意義。高溫大曲和中高溫大曲可明顯的劃分為兩組，中高溫大曲樣品CZ2和CZ3雖然偏離較遠，但根據主成分一(79.55%)可與其余樣品聚為一類，說明高溫大曲和中高溫大曲真菌群落結構具有明顯的不同。

圖5 大曲PCoA分析圖Fig.5 PCoA analysis of Daqu

為了找出不同大曲中呈現顯著性差異的物種，對大曲中的優勢真菌進行LEfSe(LDA effect size)分析，通過LDA(linear discriminative analysis)值來估算每個物種的豐度對組間差異效果影響的大小[11-12]，進一步明確高溫大曲和中高溫大曲獨特的微生物類群(圖6)。

圖6 大曲微生物組LEfSe分析柱狀圖Fig.6 Histogram based on LEfSe analyses of microbiome in Daqu

LEfSe分析柱狀圖展現了高溫大曲和中高溫大曲中具有顯著性差異的真菌微生物，柱的長度代表差異物種的影響值大小。結果表明，高溫大曲的Thermomyceslanuginosus和Wallemiasp.與中高溫大曲具有顯著性差異，中高溫大曲的Issatchenkiaorientalis、Saccharomycopsisfibuligera、Aspergillusoryzae、Candidatropicalis、Trichosporonasahii、Wickerhamomycesanomalus、Rhizomucorpusillus與高溫大曲具有顯著性差異。

疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)是一種分布廣泛的、能夠在高溫條件下生存的特殊真菌，其最低生長溫度高于20 ℃，在低于19 ℃的環境中無法生長，而最高生長溫度可達50 ℃以上[13-14]。它能產生具有高熱穩定性和活力的纖維素酶、蛋白酶、幾丁質酶、β-葡聚糖酶等，有利于釀造過程中產酒生香[15-19]。

Wallemia屬是一種廣泛分布的耐高滲透壓真菌，包含耐旱、嗜熱和嗜鹽的物種，在各種環境中均有發現，如干燥、腌漬或高糖食物、干飼料、曬鹽場、鹽晶體、室內外空氣中[20]。目前該屬共有8個物種，國內最早于2006年報道從土壤中分離出1株Wallemiasebi，其在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上對植物病原菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)以及大麗花輪枝菌(Verticilliumdahliae)具有很強的抑制作用[21]。在高溫大曲中發現的Wallemiasp.屬于未知的Wallemia物種，且含量不高((4.25±2.78)%)，推測其是1種嗜熱的Wallemia真菌，其在大曲中的作用需要進一步研究。

東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)在汾酒[22]、白云邊酒[23-24]和葡萄酒[25-26]的釀造過程中均有發現，是一種廣泛存在于釀酒生產中的能夠產生乙醇的酵母菌[27]。劉婷婷[23-24]在白云邊酒醅中分離得到了1株耐高溫、耐高酒精度且產乙酸乙酯能力強的東方伊薩酵母菌株，具有較強的產乙醇能力，是白云邊酒釀造過程中的優勢酵母菌株。LI等[22]對汾酒發酵生產過程中真菌多樣性進行分析發現，東方伊薩酵母是汾酒發酵過程中含量最高的酵母。該研究發現，中高溫大曲中東方伊薩酵母的含量最高(38.22%)，表明中高溫大曲可能是發酵過程中東方伊薩酵母的主要來源。

扣囊復膜酵母菌(Saccharomycopsisfibuligera)廣泛分布于自然界中，能夠分泌α-淀粉酶[28-29]、蛋白酶[30]在內的多種水解酶，在發酵行業中具有廣泛的應用[31]。目前已從清香型大曲[32]、濃香型大曲[33]、醬香型大曲[34]、糯米酒曲[35]和黃酒曲[36]中分離得到該種酵母菌，本研究也在中高溫大曲中發現了扣囊復膜酵母且含量較高(25.66%)。扣囊復膜酵母不但能夠在窖池中發酵產生乙醇[29]，還可以提高大曲酒中多種醇和酯的含量[37-38]，使原酒品質有所提高。除東方伊薩酵母和扣囊復膜酵母菌外，中高溫大曲中的熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)和阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)也具有提高乙酸乙酯產量[39-40]、分泌β-葡萄糖苷酶[41]的能力，從而使得原酒的風味更加協調、豐滿。

米曲霉(Aspergillusoryzae)是食品釀造中的常用菌株，尤其在醬油的釀造過程中的應用最為廣泛[42-43]，其安全性能已得到了廣泛認可[44-46]。米曲霉具有酶系豐富，酶活高，適應能力強，不產毒素等特點[47]，產淀粉酶[48-49]、蛋白酶[50-51]、脂肪酶[52]、纖維素酶[53]和果膠酶[54]的能力非常強。本研究發現米曲霉在中高溫大曲中的含量較高(21.40%)，是中高溫大曲的主要霉菌，其較強的產淀粉酶能力有助于提高大曲的糖化力和液化力，而產生的脂肪酶則對釀造過程中乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等骨架風味物質的形成有一定的促進作用。此外，雖然微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)在中高溫大曲中的含量較低，僅有(1.29±0.28)%，但其產生的α-淀粉酶則具有較好的熱穩定性和pH耐受性[55]。

3 結論與討論

高溫大曲和中高溫大曲是以制曲過程中能達到的最高溫度來區分的，高溫大曲主要用于醬香型白酒的生產，其生產過程中最高溫度約為60～70 ℃，中高溫大曲主要用于濃香型白酒的生產，其生產過程中最高溫度約為50～60 ℃，此外生產過程中最高溫度低于50℃的低溫大曲則主要用于清香型白酒的生產[56]。由于大曲生產過程中原料、環境和生產工藝的差異，不同大曲擁有不同的微生物菌系和酶系，使得糖化力、液化力和酯化力等理化指標有所差異。張春林[57]對瀘州老窖生產的中、高溫大曲進行研究發現，中高溫大曲液化酶、糖化酶、蛋白酶和纖維素酶的活性以及酯化力、產酒能力均高于高溫大曲。邢鋼等[58]對3種不同溫度大曲制曲過程的理化指標進行分析發現，高溫大曲的水分、淀粉、酸度和中溫大曲相差不大，但糖化力、液化力、酯化力和發酵力均低于中溫大曲。邢爽等[59]針對3種大曲的酯化力進行分析，結果表明低溫大曲合成乙酸乙酯和丁酸乙酯的酶活最高，中高溫大曲合成乳酸乙酯和己酸乙酯的酶活最高，而高溫大曲的酯化酶活力最小。

為了進一步分析高溫大曲和中高溫大曲菌系與酶系的不同，本研究借助高通量測序技術對2種大曲進行分析，找出了兩者真菌微生物群落結構的差異。結果表明高溫大曲和中高溫大曲所含OTU數量接近，差異不顯著，但中高溫大曲真菌的群落多樣性顯著高于高溫大曲；霉菌是構成高溫大曲的主要真菌，其中疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)和Wallemiasp.為高溫大曲所特有，Aspergillusintermedius也是高溫大曲中的優勢菌，含量在10.95%左右；酵母菌則是構成中高溫大曲的主要真菌，霉菌僅占真菌含量的1/4左右，東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)為中高溫大曲所特有。大量的酵母菌保證了中高溫大曲具有較高的發酵力、液化力、酯化力及產酒能力，而米曲霉則保證了中高溫大曲液化酶、糖化酶、蛋白酶和纖維素酶的活性；高溫大曲在生產過程中最高溫度超過60 ℃，酵母菌、米曲霉等不耐高溫的微生物難以生長，使得高溫大曲發酵力、液化力、酯化力及產酒能力較低，而耐高溫疏綿狀嗜熱絲孢菌分泌的高熱穩定性酶使得高溫大曲具有獨特的生香作用。

胡佳音等[8]采用高通量測序對清濃醬3種大曲真菌多樣性進行分析發現，謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)和疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)為高溫大曲中的主要真菌，分別占43%和34.8%；謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)和嗜熱子囊菌(Thermomyceslanugin)為中高溫大曲的主要真菌，分別占52%、11.7%、8.9%和6.2%。徐占成等[60]對川派濃香型白酒中高溫大曲進行高通量測序，結果表明Rhizopus、Saccharomycopsis、Aspergillus和Thermoascus等屬為劍南春大曲的優勢真菌。李申奧[61]對湖北白云邊高溫大曲真菌群落結構進行解析發現，Thermomyces屬、Candida屬和Aspergillus屬為出房高溫大曲的優勢真菌，其占比分別為77.89%、12.60%和8.53%。本文所分析的大曲均采集于皖北某知名酒企，該企業是皖派白酒的代表企業，對其生產的高溫大曲和中高溫大曲進行分析能夠反映皖派白酒大曲的真菌群落結構。與其他產區相比，該地區高溫大曲的真菌群落結構與白云邊高溫大曲類似，嗜熱真菌屬(Thermomyces)均占據主要地位，與胡佳音[8]的研究結果相比并未發現謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)。中高溫大曲中曲霉屬(Aspergillus)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)含量遠高于劍南春中高溫大曲，而根霉屬(Rhizopus)含量遠低于劍南春中高溫大曲，也未發現胡佳音[8]研究結果中占主要地位的謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)。

大曲中含有豐富的菌系和酶系，通過高通量測序技術對真菌群落結構進行分析明確了大曲中的微生物種類和相對豐度，了解大曲中主要優勢菌的演變規律，更有效地幫助白酒企業認知大曲在釀酒過程中的作用。