褪黑素對(duì)雨生紅球藻蝦青素和油脂合成的影響

崔靜，丁巍，余旭亞，趙永騰，彭俊

1(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500) 2(云南省第一人民醫(yī)院胸外科，云南 昆明，650228)

天然蝦青素是一種具有強(qiáng)抗氧化特性的葉黃素類胡蘿卜素，其抗氧化性分別是VE和番茄紅素的550倍和55倍，被譽(yù)為“超級(jí)維生素E”，廣泛應(yīng)用于功能食品和制藥行業(yè)[1-3]。天然蝦青素可從細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌以及甲殼類動(dòng)物中獲得[4]，而雨生紅球藻(H.pluvialis)因其生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)條件易控制且蝦青素含量高，被認(rèn)為是天然蝦青素的最佳來(lái)源[5-6]。

脅迫條件下，當(dāng)雨生紅球藻中葉綠素及初生類胡蘿卜素不足以保護(hù)細(xì)胞免受損傷時(shí)，蝦青素會(huì)大量合成。然而，環(huán)境脅迫同時(shí)也會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，使得細(xì)胞的生長(zhǎng)受到阻礙[7-9]。雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)存在兩套清除活性氧的防御體系：一類為酶促系統(tǒng)(短期機(jī)制)；另一類為非酶促系統(tǒng)(長(zhǎng)期機(jī)制)，主要產(chǎn)物為蝦青素。在脅迫條件下，作為信號(hào)分子的ROS迸發(fā)，激活雨生紅球藻兩套抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行防御[10],但ROS水平的急劇增加可能會(huì)影響抗氧化酶的活性。β-胡蘿卜素酮醇酶(β-carotenoidketolase,BKT)是蝦青素合成過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵酶,催化β-胡蘿卜素形成β-胡蘿卜素衍生物角黃質(zhì)，然后進(jìn)一步被催化形成蝦青素[11],bkt基因表達(dá)量的提高可以有效提高β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為角黃質(zhì)的效率，從而提高蝦青素的合成效率。有報(bào)道指出，在脅迫條件下蝦青素的積累與脂質(zhì)合成密切相關(guān)[12]。ω-3脂肪酸去飽和酶(fattyaciddesaturase，F(xiàn)AD)酶基因fad作為脂質(zhì)合成途徑上的一個(gè)關(guān)鍵酶基因，其表達(dá)量水平也會(huì)間接影響蝦青素的積累。

褪黑素(melatonin,MLT)，是一種甲氧基吲哚胺，是色氨酸的衍生物[13-14]，已有研究證明外源褪黑素處理能夠增強(qiáng)植物抵御逆境的能力[15]。徐向東等[16]在高溫脅迫條件下向黃瓜幼苗葉面噴施褪黑素，發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗葉片H2O2和丙二醛(MDA)的積累被有效抑制，抗氧化物質(zhì)改性樹脂(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量及抗壞血酸代謝相關(guān)酶——抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性被提高。蝦青素作為雨生紅球藻應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的主要次生代謝產(chǎn)物，MLT對(duì)其合成的調(diào)控作用和作用機(jī)理方面的研究鮮有報(bào)道。

該試驗(yàn)以雨生紅球藻H.pluvialisLUGU為對(duì)象，在高光照聯(lián)合缺氮條件下，研究外源MLT誘導(dǎo)對(duì)其生長(zhǎng)、蝦青素積累和油脂積累的影響以及對(duì)抗氧化酶SOD,CAT和POD活性的影響，同時(shí)分析了MLT對(duì)蝦青素和油脂合成相關(guān)酶基因表達(dá)量的影響。為提高蝦青素的產(chǎn)量及MLT誘導(dǎo)其合成機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 雨生紅球藻的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

雨生紅球藻H.pluvialisLUGU為云南省高原淡水湖瀘沽湖水樣中分離純化所得[17]。以BBM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在鼓泡式光生物反應(yīng)器(直徑0.2 m，高0.3 m，容積3 L)中培養(yǎng)，(其中含2 L BBM培養(yǎng)基)，并以0.1 vvm/min的速度通入無(wú)菌空氣，光照強(qiáng)度為2800 lx，室內(nèi)恒溫(25±1)℃，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)后期(大約9.0×105cells/mL)。

采用3 800×g離心5 min，無(wú)菌水洗滌兩次，以去除殘留的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。將所獲的藻液沉淀，并重新懸浮至缺氮的BBM(500 mL錐形瓶，其中含360 mL培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，最初的細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105cells/mL。用二甲基亞砜(DMSO)溶解MLT作為母液，添加同樣體積MLT至缺氮BBM培養(yǎng)基中，使MLT最終濃度為10 μmol/L，每組設(shè)3個(gè)平行樣。以0.4 vvm/min的速度通入無(wú)菌空氣，光照10 000 lx，溫度保持在(27±1) ℃，室內(nèi)培養(yǎng)13 d。每隔1天進(jìn)行取樣，測(cè)定H.pluvialisLUGU生物量、蝦青素含量及油脂含量。

1.2 雨生紅球藻細(xì)胞生物量濃度、蝦青素和脂質(zhì)含量的測(cè)定

為測(cè)定H.pluvialisLUGU的干細(xì)胞重量(DCW)，每隔1天取10 mL的誘導(dǎo)藻液，在3 800×g離心5 min，所獲沉淀用蒸餾水洗滌2次，收集沉淀，置于EP管中，儲(chǔ)存于-20 ℃，冷凍干燥并稱重。

利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定蝦青素含量。取各干燥樣品10 mg，充分研磨，然后用丙酮：氯仿(1∶1，體積比)溶液提取干藻粉中的蝦青素， 4 ℃條件下，12 000 r/min離心5 min。多次重復(fù)此過(guò)程，至藻細(xì)胞變?yōu)榘咨⑻崛『蟮娜芤褐糜?5 ℃真空干燥箱完全干燥。隨后用1 mL甲醇：二氯甲烷(3∶1，體積比)溶液溶解干燥的提取物，HPLC上樣檢測(cè)。其中，HPLC條件為：流動(dòng)相A為丙酮，流動(dòng)相B是體積比為9∶1的甲醇∶水溶液。洗脫梯度為：B，80%～20%，25 min； B，20%，10 min； B，20%～80%，15 min;進(jìn)樣量20 μL,流速為1.25 mL/min;光譜掃描波長(zhǎng)范圍為250～700 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為476 nm。用液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蝦青素質(zhì)量濃度ρ(mg/L)，蝦青素含量為：

P(mg/g)=ρ(mg/L)/ DCW(g/L)

(1)

收集干藻粉，稱取干藻粉-石英砂(1∶ 2, 質(zhì)量比),研磨30 min，然后取1.0 g研磨好的干藻粉加入氯仿-甲醇(2∶ 1, 體積比)，室溫下振蕩20 min。3 000 r/min離心10 min，收集上清，沉淀再用氯仿-甲醇(2∶1, 體積比)重復(fù)提取2～3次，然后合并多次提取有機(jī)相，40 ℃旋蒸，70 ℃干燥2 h，冷卻至室溫后稱重。油脂含量按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：WL，提取的總脂質(zhì)量，g；WA，藻粉干質(zhì)量，g。

1.3 ROS、酶活及MDA的測(cè)定

利用2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)測(cè)定雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量[18]。DCFH-DA作為熒光探針,本身不具有熒光性，透過(guò)雨生紅球藻細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成非熒光的二氯熒光黃(DCFH),當(dāng)ROS存在時(shí), DCFH被氧化為不能透過(guò)細(xì)胞膜的綠色熒光物質(zhì)DCF。

取微藻培養(yǎng)液5 mL,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL,離心后棄去上清液,將1 mL 10 μmol/L CFH-DA添加至培養(yǎng)基中,避光于37 ℃搖床中振蕩反應(yīng)30 min,離心棄上清液,使用PBS緩沖液洗滌2次以除去未反應(yīng)的DCFH-DA，使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)500～600 nm,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

用總超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(beyotime，China)測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性，CAT和POD的活性分別利用過(guò)氧化氫酶試劑盒(beyotime，China)和過(guò)氧化物酶試劑盒(Beyotime，China)進(jìn)行測(cè)定。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)的含量是根據(jù)Heath和Parker的研究方法進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)擴(kuò)增

使用Trizol試劑提取總RNA。首先液氮研磨微藻樣品，刮1～2勺研磨好的藻粉到已加入1 mL Trizol的1.5 mL EP管中，蓋好蓋子，搖晃均勻，室溫下靜置5 min，然后在4 ℃，12 000 r/min條件下離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加0.2 mL氯仿，劇烈搖晃15 s，室溫放置2～3 min，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心15 min，并吸取上清液至新的EP管中；加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置培養(yǎng)10 min，然后在4 ℃，12 000 r/min條件下離心10 min，離心后將除管底白色固體外的液體用槍吸除，加入1 mL 75%的乙醇，渦旋振蕩2～3 min，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心5 min，再次將除管底白色固體外的液體用槍吸除，剩余晾干；晾干后加入30～50 μL Rnase-free水，用槍輕輕吹打混勻，將57 μL水加入PCR管中，再加入3 μL RNA，以備RNA濃度測(cè)定，將原RNA液體放置于-80℃待逆轉(zhuǎn)錄。然后用RT-PCR試劑盒(Takara)對(duì)1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，使用ABI 7500熒光定量?jī)x分析bkt和fad相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。表1為內(nèi)參基因18S、bkt、fad的熒光定量引物。其中內(nèi)參基因的作用即作為內(nèi)標(biāo)以調(diào)節(jié)RNA的用量和循環(huán)數(shù)，使內(nèi)標(biāo)基因在誘導(dǎo)條件下的表達(dá)豐度一致。qRT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

表1 酶基因熒光定量引物

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，采用ANOVA(SPSS 20.0)一步法分析所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)調(diào)查不同試驗(yàn)的組間差異，當(dāng)p<0.05時(shí)具有顯著性意義，p<0.01具有極顯著性意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 MLT對(duì)H.pluvialis生物量及蝦青素含量的影響

環(huán)境脅迫條件下，雨生紅球藻細(xì)胞生物量會(huì)受到影響。圖1-a顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和褪黑素誘導(dǎo)組的生物量濃度均逐漸增加，但增長(zhǎng)緩慢，至第13 d分別達(dá)到最大值0.61和0.59 g/L，外源MLT并不能促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，李大菲等[20]也得到相同的結(jié)果，褪黑素對(duì)單針藻Monoraphidiumsp. QLY-1細(xì)胞生長(zhǎng)未表現(xiàn)出積極作用。

雨生紅球藻在脅迫條件下會(huì)大量積累蝦青素。如圖1-b所示，在13 d的誘導(dǎo)過(guò)程中，對(duì)照組蝦青素含量逐步增加并最終達(dá)到最大值14.36 mg/g。而褪黑素作為一種信號(hào)分子和抗氧化劑，其外源添加顯著促進(jìn)了雨生紅球藻蝦青素含量的提高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褪黑素處理組蝦青素含量逐漸升高，且相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，增長(zhǎng)速率也在不斷提高，至第13天蝦青素含量達(dá)到最大值32.37 mg/g，是對(duì)照組的2.25倍。由此可知，脅迫條件下，添加外源MLT雖然對(duì)微藻生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，但可以顯著提高雨生紅球藻中蝦青素積累。這與先前報(bào)道的誘導(dǎo)策略相比，如添加H2O2、叔丁基羥基茴香醚(BHA)誘導(dǎo)或采用不同光照強(qiáng)度，獲得了更高的蝦青素積累量[21-22]。

圖1 (a)MLT對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響;(b)MLT對(duì)雨生紅球藻蝦青素含量的影響Fig.1 (a)Effect of MLT on the growth of H. pluvialis;(b)Effects of MLT on astaxanthin content of H. pluvialis 注：*表示同一時(shí)間與其他組差異顯著(p<0.05)； **表示同一時(shí)間與其他組差異極顯著(p<0.01。

2.2 MLT對(duì)H.pluvialis LUGU脂質(zhì)含量的影響

KARSTEN[12]研究發(fā)現(xiàn)，在高等植物代謝過(guò)程中，類胡蘿卜素主要儲(chǔ)存在葉綠體等質(zhì)體內(nèi)，而雨生紅球藻合成的 95%的蝦青素與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)，儲(chǔ)存在富含有甘油三酯的脂囊泡中[23]。因此雨生紅球藻蝦青素的積累與脂質(zhì)合成密切相關(guān)。外源MLT對(duì)H.pluvialis脂質(zhì)含量的影響如圖2所示。在13 d的誘導(dǎo)過(guò)程中，脂質(zhì)含量逐漸增加，且與蝦青素積累量增加的趨勢(shì)一致。MLT誘導(dǎo)組中，脂質(zhì)最高含量達(dá)到42.84%，是對(duì)照組(35.19%)的1.22倍。結(jié)果表明，褪黑素誘導(dǎo)促進(jìn)了脂質(zhì)的生物合成。這可能是由于褪黑素作為一種誘導(dǎo)劑，增加了脂質(zhì)的合成，從而促進(jìn)了蝦青素的酯化存儲(chǔ)，減輕了游離蝦青素的產(chǎn)物抑制作用[23]；另外，作為一種抗氧化劑，褪黑素可以防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并維持雨生紅球藻細(xì)胞生物膜的正常功能，保持了細(xì)胞正常代謝活性[24]。

圖2 MLT對(duì)雨生紅球藻脂質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of MLT on lipid content of H. pluvialis 注：*為同一時(shí)間與其他組差異顯著(p<0.05)； **為同一時(shí)間與其他組差異極顯著(p<0.01)。

2.3 MLT對(duì)H.pluvialis LUGU細(xì)胞內(nèi)ROS水平、抗氧化酶活及MDA含量的影響

ROS是在多種生物細(xì)胞中均存在的一種重要的信號(hào)分子，其對(duì)雨生紅球藻蝦青素合成的促進(jìn)作用已經(jīng)被證明[25]。然而，ROS能與細(xì)胞內(nèi)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等一些主要的大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[26-27]。雨生紅球藻細(xì)胞中存在酶系和非酶系兩套自由基清除系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)生物或非生物脅迫產(chǎn)生的有毒化合物[28]。

如圖3-a所示，在缺氮和高光脅迫條件下，對(duì)照組和褪黑素誘導(dǎo)組，培養(yǎng)初期ROS水平均表現(xiàn)為逐漸升高趨勢(shì)；但兩組相互比較發(fā)現(xiàn)，在13 d的培養(yǎng)過(guò)程中，褪黑素組ROS水平均低于對(duì)照組，這可能是由于MLT作為一種抗氧化劑，可以清除藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，抑制ROS水平的升高。從第5天起，ROS水平開(kāi)始急劇下降，這可能由于培養(yǎng)前期ROS水平的升高激活了藻細(xì)胞的酶促抗氧化防御系統(tǒng)，抗氧化酶活性的增強(qiáng)抑制了ROS水平的持續(xù)升高。該研究測(cè)定了SOD、CAT和POD 3種重要抗氧化酶的活性。如圖3-b所示，SOD活性在第5天時(shí)達(dá)到最高，同樣的，CAT與POD活性也在第5 d時(shí)達(dá)到最高，這與ROS水平在培養(yǎng)至第5 d時(shí)開(kāi)始急劇下降相一致。然而， SOD、CAT和POD的活性在第9 d和第13 d出現(xiàn)了降低。這可能是由于藻細(xì)胞中酶系防御體系會(huì)對(duì)ROS的增加產(chǎn)生快速應(yīng)答反應(yīng)，但ROS造成的細(xì)胞損傷也是廣泛的，隨著時(shí)間的推移，蛋白質(zhì)會(huì)被降解，因此酶活性降低；另外，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高通常會(huì)觸發(fā)細(xì)胞自噬，這也使得部分細(xì)胞成分被降解[29]。

*為同一時(shí)間與其他組差異顯著(p<0.05)； **為同一時(shí)間與其他組差異極顯著(p<0.01)圖3 (a) MLT對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(b) MLT對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)SOD活性的影響(c)MLT對(duì)雨生 紅球藻細(xì)胞內(nèi)CAT 活性的影響(d)MLT對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)POD活性的影響(e) MLT對(duì)雨生紅球藻 細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響Fig.3 (a)Effects of MLT on ROS level in H. pluvialis cells (b) Effects of MLT on SOD activity in H. pluvialis cells (c) Effects of exogenous addition of MLT on CAT activity in H. pluvialis cells (d) Effects of MLT on POD activity in H. pluvialis cells (e) Effects of MLT on MDA content in H. pluvialis cells

MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的指標(biāo)。圖3-e顯示，當(dāng)雨生紅球藻處于脅迫條件下時(shí)，MDA的含量升高，同時(shí)，對(duì)照組MDA含量比褪黑素誘導(dǎo)組表現(xiàn)出更快的增長(zhǎng)，但在抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的作用下，MDA的含量自第5 d起逐漸下降，并與ROS水平的下降和抗氧化酶活性的升高趨勢(shì)保持一致。以上結(jié)果表明，褪黑素作為誘導(dǎo)劑，提高了抗氧化酶活性，顯著升高了雨生紅球藻抗氧化物—蝦青素含量，對(duì)增強(qiáng)微藻應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激具有顯著作用。

2.4 MLT對(duì)H.pluvialis LUGU蝦青素合成相關(guān)基因及油脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

非生物脅迫條件下外源添加化學(xué)調(diào)節(jié)劑或植物激素可上調(diào)微藻中與蝦青素和脂質(zhì)生物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)蝦青素和油脂的合成[22]。為了確定褪黑素對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響，在缺氮和高光脅迫條件下外源添加褪黑素誘導(dǎo)5 d和13 d后，對(duì)蝦青素合成途徑中關(guān)鍵基因bkt和脂質(zhì)生物合成途徑中關(guān)鍵基因fad表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定。

如圖4-a所示，外源添加褪黑素提高了bkt的轉(zhuǎn)錄水平。在第5 d，褪黑素誘導(dǎo)組中bkt基因表達(dá)量相比對(duì)照組提高了0.37倍；而在第13 d，bkt達(dá)到最大轉(zhuǎn)錄水平，為對(duì)照組的1.55倍。此外，如圖4-b顯示，外源添加褪黑素同樣提高了fad的轉(zhuǎn)錄水平。在誘導(dǎo)第5 d，fad表達(dá)水平比對(duì)照組提高了2.54倍；第13 d，提高了1.52倍。這些結(jié)果與蝦青素積累量和脂質(zhì)合成水平的增長(zhǎng)趨勢(shì)是一致的。

圖4 (a)MLT對(duì)雨生紅球藻蝦青素合成關(guān)鍵基因bkt的影響(b)MLT對(duì)雨生紅球藻脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因fad的影響Fig.4 (a) Effects of MLT on the key gene bkt of astaxanthin synthesis in H. pluvialis cells (b) Effects of MLT on the key gene fad of lipid synthesis in H. pluvialis cells 注：*為同一時(shí)間與其他組差異顯著(p<0.05)； **為同一時(shí)間與其他組差異極顯著(p<0.01)。

高政權(quán)[30]等的研究表明，外源添加植物激素SA(水楊酸)和JA(茉莉酸)，均能顯著提高蝦青素合成途徑中關(guān)鍵酶基因bkt的轉(zhuǎn)錄水平，從而促進(jìn)蝦青素的合成。LI[31]等研究也表明，褪黑素能夠通過(guò)提高M(jìn)onoraphidium中脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。本研究也得到了同樣的結(jié)果，外源MLT可以顯著提高H.pluvialis蝦青素積累與脂質(zhì)積累關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，從而提高蝦青素與油脂的積累量。

3 結(jié)論

在高光照聯(lián)合缺氮脅迫條件下，外源添加MLT對(duì)雨生紅球藻的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但顯著提高了蝦青素積累量和油脂合成水平。另外，MLT抑制了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子ROS的水平，并提高了抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性；蝦青素積累相關(guān)酶基因bkt和油脂合成相關(guān)酶基因fad表達(dá)量提高。這些變化均與藻細(xì)胞中蝦青素的積累密切相關(guān)。作為抗氧化劑和信號(hào)分子，雖然MLT誘導(dǎo)增加了雨生紅球藻蝦青素生物合成，但其作為信號(hào)分子，對(duì)藻細(xì)胞蝦青素合成相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用還有待進(jìn)一步深入研究。