酶聯免疫吸附試驗在診斷HIV感染并發結核病患者中的價值

余艷艷 譚云洪 陳振華 陳忠南 劉彬彬 王玨

結核病目前仍然是嚴重危害人類健康的全球公共衛生問題。WHO指出，2016年全球1040萬例結核病感染者中10%的患者同時并發HIV感染；2016年全球130萬例結核病死亡患者中有37.4萬例并發HIV感染[1]。結核病是HIV感染者最常見的機會感染之一，是HIV感染者疾病進展的重要促進因素[2]。國外有研究報道[3],結核病是艾滋病患者(AIDS患者)(包括已接受抗病毒治療的患者)死亡的重要因素。HIV感染并發結核病由于病情復雜，因此診斷更為困難[4]。因此，在HIV感染者中對結核病進行早期篩查與診斷尤為重要。而HIV感染并發結核病患者的臨床癥狀不典型、影像學表現無特異性、實驗室病原學檢查陽性率低，從而導致診斷困難，延誤病情[5]。酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)作為γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)的一種檢測技術，在診斷結核病方面得到了越來越多的應用。因此，本研究通過對2015年1月至2018年9月湖南省胸科醫院就診的HIV感染并發結核病的患者采用包括ELISA在內的3種檢測技術進行診斷性研究，以分析ELISA對HIV感染并發結核病的診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

搜集2015年1月至2018年9月湖南省胸科醫院臨床就診的肺部疾病患者，共4568例，用ELISA法檢測血清HIV抗體陽性，并經湖南省疾病預防控制中心采用免疫印跡法確診為陽性的患者114例。HIV感染者的診斷標準參照中華人民共和國衛生部頒布的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準(WS 293—2008)》[6]。114例HIV感染患者中，按照《WS 288—2008 肺結核診斷標準》[7]，且經過診斷性抗結核藥物治療，確診為HIV感染并發結核病患者95例，確診為HIV感染并發非結核性肺疾病患者19例。其中男100例(87.72%)，女14例(12.28%)；30歲以下年齡段10例(8.77%)，30～歲年齡段53例(46.49%)，50～歲年齡段47例(41.23%)，≥70歲年齡段4例(3.51%)。95例HIV感染并發結核病患者中包括5例繼發性肺結核并發淋巴結結核，3例繼發性肺結核并發結核性胸膜炎，7例繼發性肺結核并發淋巴結結核，1例繼發性肺結核并發腸結核，2例血行播散性肺結核，77例繼發性肺結核。19例HIV感染并發非結核性肺疾病中包括6例支氣管擴張，9例慢性阻塞性肺疾病(急性發作期)，1例非結核分枝桿菌(NTM)感染，3例肺部感染。

二、研究方法

(一)標本留取

用無菌肝素鈉抗凝管抽取每例患者的新鮮靜脈全血≥3 ml,進行ELISA檢測；均收集每例患者的痰標本(每份樣本≥3 ml)，同一份痰標本同時進行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)和分枝桿菌BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)檢測。

(二)檢測方法

1.ELISA：采用海口維提璦生物研究院研制的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應試劑盒進行檢測。無菌技術下使用肝素鈉管采集的新鮮靜脈全血≥3 ml，于室溫儲存和運輸，16 h內進行樣品刺激。編號反應管“樣本號-N”(表示陰性對照管)，“樣本號-P”(表示陽性對照管)，“樣品號-T”(表示檢測管)。分別加入相應的刺激劑(修飾后的培養濾液蛋白-10和早期分泌抗原靶-6)，吸取1 ml靜脈全血加入相應編號的反應管中并孵育22～24 h，將血漿上清移入標記好的1.5 ml Ependorff管(EP管)中。按照該試劑盒的說明書進行操作，酶標儀讀取450 nm處的光密度值(A值)。計算結果，得出(P-N)和(T-N)值。當N<0.5 IU/ml時，(T-N)/(P-N)≥0.60時判為陽性，否則為陰性。當N≥0.5 IU/ml，(T-N)/(P-N)≥0.85時判為陽性，否則為陰性(當P-N≥10 IU/ml 時，按P-N=10 IU/ml 計算)。

2.GeneXpert：按照GeneXpert操作說明書進行前處理。取1 ml痰標本加入管中，加入2倍痰體積的標本處理液，振蕩20 s后，靜置15 min，用專用吸管取2 ml處理后的標本液緩慢加入反應盒的加樣孔內。開啟GeneXpert儀和電腦，待自檢通過后，將反應盒放入模塊中，系統自動進行核酸提取、擴增，以及目標序列的檢測和結果判斷。

3. MGIT 960：按照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[8]進行操作。

三、儀器與試劑

ELISA試劑盒由海口維瑅璦生物研究所提供。MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統及配套試劑由美國BD公司生產。GeneXpert檢測儀器和試劑盒均由美國Cepheid公司提供。

四、統計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，對陽性率、敏感度、特異度、陽性預測值與陰性預測值的比較進行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 陽性檢出基本情況

95例臨床診斷的HIV感染并發結核病患者中，GeneXpert檢出陽性40例，陽性率為42.11%(40/95)；MGIT 960檢測陽性者45例，陽性率為47.37%(45/95)； ELISA檢測陽性者64例，其中不確定結果8例，陽性率67.37%(64/95)。ELISA檢測的陽性率高于GeneXpert和MGIT 960檢測，且差異有統計學意義(χ2=50.031，P=0.000)。19例HIV并發非結核性肺疾病患者中GeneXpert檢測陽性者0例； MGIT 960檢測陽性者0例； ELISA檢測陽性者 3例。

二、 ELISA試驗的診斷效能

以臨床診斷結果為標準，GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為42.11%和100.00%；MGIT 960檢測的敏感度和特異度分別為47.37%和100.00%； ELISA檢測的敏感度和特異度分別為73.56%和84.21%，見表1。

討 論

IGRA原理為檢測外周血單個核細胞或(和)全血在結核分枝桿菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素(IFN-γ)的水平，判斷受檢者是否感染結核。目前主要應用的檢測方法為：酶聯免疫斑點法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)和ELISA[9]。IGRA目前主要在活動性結核病的輔助診斷、兒童MTB感染的排查和HIV感染等免疫抑制或免疫缺陷者MTB潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)診斷中應用[10]。本研究結果顯示，ELISA檢測在HIV感染并發結核病中診斷的陽性率高于GeneXpert和MGIT 960，且差異有統計學意義；以臨床診斷結果為標準，ELISA檢測的敏感度高于GeneXpert和MGIT 960。

表1 以臨床診斷為標準3種檢測技術診斷HIV感染并發結核病的效能

注ELISA試驗中有8例HIV感染并發結核病者的結果不確定。敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性+假陰性例數)×100%

本研究中ELISA檢測的特異度為84.21%，低于GeneXpert和 MGIT 960。原因可能為本研究以臨床診斷結果為標準，有些患者為非結核分枝桿菌NTM和MTB的混合感染，但臨床上患者結核病表現不明顯；部分患者既往感染了MTB但為非活動性肺結核，本次是因為呼吸道其他疾病如支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病(急性發作期)就診；有些患者感染了與IGRA檢測抗原相交叉的NTM,如海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等有關；湖南省是結核病高發地區，不少患者為LTBI的可能性較大[11-13]。以上這些原因使得部分HIV感染并發非結核性肺疾病患者出現ELISA試驗陽性。有文獻報道，IGRA試驗檢測效能受MTB感染流行情況等影響，在低風險人群中檢測的特異度較好，但在有潛在MTB感染的高危人群中檢測的特異度明顯降低[14-16]。國外研究顯示，結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)診斷HIV感染并發活動性結核病的敏感度和特異度分別為37.2%和88.7%[17]，并建議在免疫功能高度抑制的AIDS患者中不推薦T-SPOT.TB的診斷方法，敏感度低的原因可能與在晚期HIV感染的患者中CD4+T淋巴細胞數量減少及功能降低。然而T-SPOT.TB是否確實受CD4+T淋巴細胞數量及功能影響，目前尚有爭議；Nahid等[18]的研究顯示，在HIV感染并發結核病患者中，T-SPOT.TB檢測的陽性率并不受CD4+T淋巴細胞計數的影響。這些研究說明，T-SPOT.TB具有一定輔助診斷價值，但陰性檢測結果也不能完全排除結核病。有研究指出，ELISA和PPD試驗均是檢測患者細胞免疫反應，用MTB特異性抗原刺激患者T淋巴細胞，觀察是否有特異性細胞免疫反應來間接判斷是否感染MTB；因為正常人的CD4+T淋巴細胞約占總T淋巴細胞的65%，所以這兩種檢測方法均與CD4+T淋巴細胞計數和活性有關[19-20]。同時有文獻指出，ELISA陰性可以排除未受到嚴重免疫抑制的HIV感染成人的活動性結核病[21]。

有學者研究表明，由于ELISA試驗設置了空白對照管和陽性對照管，可以評價被檢者的基礎免疫狀態和試驗操作是否得當(陽性對照管)來排除受試者體內嗜異性抗體效應和非特異性的IFN-γ等影響(空白對照管)，從而提高了方法學的可靠性[22-24]。HIV感染人群中，LTBI潛伏性感染者僅1年中就有約10%的幾率發展成活動性結核病，遠超非HIV感染人群[25]。LTBI和活動性結核病是相互關聯而非相互獨立的，特別是在HIV感染者中，可能在相當短的時間內經歷了LTBI、亞臨床結核病到活動性結核病的病情轉變[26]。因此，在HIV感染者中對LTBI者的早期檢測手段至關重要。由于ELISA檢測有著較高的敏感度和特異度，并且檢測快捷，故對HIV感染并發結核病的輔助診斷有一定的意義。

本研究不足之處在于：ELISA試驗中由于檢測管淋巴細胞產生IFN-γ受被檢者淋巴細胞數量、活力、體質量指數(BMI)、是否吸煙、高濃度C反應蛋白(C-reaction protein，CRP)等多種因素影響[27-28]，本研究未能深入分析這些因素對檢測結果的具體影響，也不知8例不確定結果的具體原因。GeneXpert與 MGIT 960屬于病原學檢測方法，標本來源于痰液；ELISA屬于免疫學檢測方法，標本來源于血液。有研究顯示[29],痰標本的性狀與痰菌檢查結果密切相關，以干酪痰和膿性痰陽性檢出率較高，血性痰及泡沫樣痰陽性率較低。痰標本的性狀對GeneXpert和 MGIT 960檢測結果有一定影響。不同的標本來源及標本性狀對GeneXpert、MGIT 960與ELISA檢測結果存在不同影響。目前臨床上HIV感染并發結核病的病原學陽性檢出率低，鑒于ELISA檢測的高敏感度與特異度，故將其與GeneXpert及 MGIT 960進行比較，以臨床診斷結果為標準評價ELISA的臨床診斷價值。另外，由于本研究HIV感染并發非結核性肺疾病患者例數少，有待增大樣本量進一步研究，以便正確評價ELISA檢測技術在HIV感染并發結核病患者中的臨床診斷價值。