交叉引物擴增技術在結核病診斷中的應用

林百豐 蘇欣 張學志

結核病是長期危害人類健康的慢性傳染病，是嚴重的公共衛生問題。據2017年WHO報告估算全球共有1040萬例結核病新發患者，平均發病率為140/10萬，而我國肺結核發病患者例數居世界第3位，僅次于印度和印度尼西亞[1]。在2016年全球登記的540萬例新發和復發的肺結核患者中有57%有細菌學證據，其余患者是根據胸部影像檢查和患者的癥狀等被確診為肺結核。目前，我國的肺結核診斷多以胸部X線攝影為主，具有病原學依據的肺結核僅為31%，這與我國仍然使用傳統的方法診斷傳染性肺結核有關。由于傳統的痰涂片顯微鏡檢查法敏感度低；痰培養檢查法雖敏感度高，但耗時較長。原有的結核病診斷方法已不能滿足早診斷早治療的需求，所以我國的科研工作者利用分子生物學和基因組學檢測快的優點，研制出很多新型的結核病核酸診斷技術和方法。本研究使用的交叉引物擴增技術(crossing priming amplification，CPA)就是其中之一。筆者將CPA與傳統痰涂片顯微鏡檢查法和痰培養法進行效能分析，評價CPA在結核病診斷中的應用價值。

對象和方法

一、研究對象

采集2017年5月至2018年3月五常市結核病防治所門診初診疑似肺結核患者的痰標本，按照《WS 288—2008肺結核診斷標準》進行診斷[2]，最終納入267例肺結核患者，64例非結核性肺疾病患者，男200例，女131例。

二、 試劑和方法

1. 方法：由門診醫生指導患者留取3份合格的痰標本(即時痰、夜間痰和晨起痰)，每份痰標本約3～5 ml，分別進行痰涂片、痰培養和CPA檢測。痰涂片檢查嚴格按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[3]的要求進行，痰培養檢查按照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[4]的標準化操作執行。

痰涂片檢查：采用萋-尼抗酸染色法。使用一端有磨砂面的無劃痕的新玻片，經95%乙醇脫脂，干燥、清潔后用2B鉛筆在磨砂面上注明實驗序號及標本序號；在生物安全柜中，小心打開承載痰標本的容器，防止產生氣溶膠或使標本外溢, 仔細觀察標本，使用折斷的竹簽毛茬端，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05 ml，于玻片正面涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置在生物安全柜中自然干燥后進行染色鏡檢。

痰培養檢查：采用固體培養法。在生物安全柜內將約2 ml痰標本置于相應的前處理管中；使用吸管將與痰標本等體積4% NaOH加入前處理管中；旋緊處理管螺旋蓋，將處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30 s左右,將前處理管置于生物安全柜試管架內，室溫靜置15 min,以無菌吸管吸取前處理后的痰標本，均勻接種至酸性羅氏培養基斜面上，每支培養基接種約0.1～0.15 ml，旋上培養管螺旋蓋，不要太緊；將培養基放置在斜面放置架上，保持培養基斜面水平向上；置于恒溫培養箱內，(36±1) ℃孵育；24 h后，擰緊培養管螺旋蓋，直立放置，繼續孵育。接種后第3天和第7天觀察培養情況，此后每周觀察1次，直至第8周末。

CPA 檢測：痰液中加入2～3倍體積的4%NaOH溶液，消化處理15 min，取消化好的溶液1 ml，置于1.5 ml離心管中，離心半徑為8.8 cm,13 000 r/min離心5 min，離心沉淀用無菌生理鹽水洗滌(重復2次)；洗滌后的沉淀中加入40 μl DNA提取液，經95～100 ℃裂解10 min后，離心半徑為8.8 cm,13 000 r/min離心5 min。離心后的上清液作為CPA恒溫擴增的DNA模板。每支玻璃化試劑反應管中加入15 μl緩沖液，然后加入20 μl石蠟油(防止污染)，靜置2～3 min，待充分溶解后；分別給每個反應管中加入4 μl DNA樣本，4 μl標準陰性對照和4 μl標準陽性對照，置于(63±2) ℃ 恒溫金屬浴60 min。待反應結束后，取出反應管依照說明書進行操作，15 min后讀取結果并記錄試驗結果[5]。結果判讀：先觀察檢測線(T線)，如果T線出現紅色，則判定為陽性，即當前樣本中有結核分枝桿菌核酸檢出；如果T線沒有出現紅色，而質控線(C線)出現紅色，則判定為陰性，即當前樣本中沒有結核分枝桿菌核酸檢出；如果T線和C線都沒有出現紅色，說明檢測失敗。

2．試劑：痰涂片染色劑和痰培養的酸性羅氏培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司；培養使用的4% NaOH為本實驗室配置；結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(恒溫擴增-試紙條法)及干式恒溫金屬浴為杭州優思達生物技術有限公司生產。

三、質量控制

痰涂片顯微鏡檢查和痰培養檢查：為了保證試驗的質量，應嚴格按照《結核病實驗室檢驗規程》[6]質量保證的要求執行。每批培養基都用H37Rv標準株做質量控制。CPA的質量控制嚴格按照《結核病實驗室質量保證手冊》[7]的要求執行。

四、 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析，計數資料采用“率(%)”表示，采用配對卡方檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。計算CPA的檢測效能指標：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%[8]。

結 果

331例患者中痰涂片檢測陽性66例，陰性265例；痰培養陽性136例，陰性195例；CPA檢測陽性137例，陰性194例。以痰培養檢查結果為標準，CPA檢測的敏感度和特異度分別為98.94%(186/188)、92.31%(132/143)。以臨床診斷為標準，痰涂片檢查的敏感度和特異度分別為23.97%(64/267)、96.88%(62/64)；痰培養檢查敏感度和特異度分別為 48.69%(130/267)、90.63%(58/64)；CPA檢查的敏感度和特異度分別為 51.31%(137/267)、96.88%(62/64)，見表1。 分別對痰涂片與痰培養、痰涂片與CPA的敏感度進行了統計學分析，差異均有統計學意義(χ2=62.23，P<0.01；χ2=69.05，P<0.01)，痰培養與CPA的敏感度進行比較，差異無統計學意義(χ2=1.50，P=0.219)；分別對痰涂片與痰培養、痰涂片與CPA檢測、痰培養與CPA檢測的特異度進行了比較，差異均無統計學意義(χ2=1.50，P=0.219；χ2=0.50，P=1.000；χ2=1.50，P=0.219)。

討 論

早期診斷和治療對結核病的預防控制至關重要，我國現有的基層結核病實驗室診斷結核病主要以傳統痰涂片檢查和痰培養檢查為主。常規痰涂片檢查方法簡單、快速、特異度高、成本低廉，但敏感度低，每毫升標本中含量5000～10 000條菌以上才能檢出。痰培養檢查法是目前結核病診斷的“金標準”，敏感度高但耗費的時間較長，每周都需要觀察培養結果，至少3～4周才能獲得結果，操作需要嚴格控制標本前處理時間，對實驗室人員的操作水平要求較高，培養出陽性菌株后需要進一步的菌種鑒定，才可確診是否為結核分枝桿菌。

與目前廣泛使用的熒光PCR技術相比較，CPA技術反應速度快，反應時間約1 h，使試劑盒可用于檢驗檢疫、突發性傳染病的檢測與監控現場檢測或醫院的床邊診斷，檢測成本低：目前熒光光定量PCR儀價格昂貴，無法在很多中小醫院普及。CPA技術只需要離心機和一臺簡單的恒溫裝置，如普通的水浴鍋、金屬浴，即可進行擴增。操作簡單，對操作人員的技能要求不高，絕大多數人通過簡單培訓或自學都可掌握，為核酸檢測試劑的廣泛應用創造了條件。

表1 以臨床診斷為標準比較3種檢測方法對結核病的檢測效能

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%，特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%,陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%,陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

本研究中CPA檢測以痰培養檢測結果為標準，其敏感度和特異度分別為98.94%和92.31%。國內有報道可疑肺結核患者應用CPA檢測敏感度為85.71%，特異度為98.92%[5,9]。以培養法為參照CPA檢測結核分枝桿菌的敏感度分別為89.7%、89.8%、83.72%，特異度分別為92.9%、87.4%、98.98%[10-12]。從以上的敏感度和特異度的比較可以看出本研究以痰培養為標準，CPA的敏感度均高于其他方法，而特異度基本與其他研究保持一致的水平。由于本次采集的是X線胸片異常患者的標本進行的研究，從而使檢測的敏感度有了很大的提高。如果在擴大標本量，CPA檢測的敏感度和特異度可能還會有所提高，檢測的結果會更加的準確。

以臨床診斷為標準，痰涂片、痰培養和CPA檢測的敏感度分別為23.97%、48.69%和51.31%，可以看出CPA檢測的敏感度較高，對于痰涂片檢測陰性，而痰培養正在等待時，在短時間內確定排菌患者有非常大的意義，但其不能確定死菌與活菌；痰涂片、痰培養和CPA檢測的特異度分別為96.88%、90.63%和96.88%，CPA檢測的特異度與痰涂片檢測的特異度相同，但略高于痰培養的特異度，而且CPA檢測縮短了時間，從收集標本到檢測出結果約需2 h，更符合我國結核病早發現、早診斷、早治療的需求。

綜上所述，CPA檢測對實驗室的生物安全和實驗室人員的技術水平要求不高，大大縮短了檢測時間，并且CPA的敏感度和特異度比較高，因此，很適合在縣(區)級結核病實驗室中推廣和應用。