多色探針熔解曲線法在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測中的應(yīng)用

蔚鳴 許鑫鑫 閆朋 張寶慶 劉春濤 吳景秋 劉玉琴 王開利 侯艷杰

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年報告，2017年全球估算耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)患者為55.8萬例，僅有約25%的患者接受檢測和治療。因單一結(jié)核病死亡130萬例，結(jié)核病仍然是高于艾滋病在內(nèi)的傳染病中的“頭號殺手”。估算中國MDR/RR-TB患者5.8萬例,居世界第二位，是全球結(jié)核病第二高負(fù)擔(dān)國家[1]；MDR/RR-TB患者納入治療率為22.5%，可見，MDR/RR-TB患者的診治缺口巨大。結(jié)核病中95%為肺結(jié)核[2]，其傳播方式為飛沫傳播，已證明傳播是導(dǎo)致耐多藥結(jié)核病疫情上升的主要原因[3]。因此迫切需要簡便、快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的診斷活動性結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的方法，對快速提高結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)率及病原學(xué)陽性檢出率，早期診治及規(guī)范化管理，快速篩查MDR/RR-TB、提高其治愈率及有效控制其傳播將發(fā)揮重要作用。

目前，結(jié)核分枝桿菌MTB比例法藥敏試驗是耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測報告時限長，在4～8周不等，嚴(yán)重制約耐藥結(jié)核病患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離的管理措施。WHO推薦的GeneXpert MTB/RIF及線性探針檢測技術(shù)(LPAs)存在儀器價格昂貴、試劑成本高及檢測藥物僅為一線抗結(jié)核藥物等問題。我國自主研發(fā)的獲多項專利技術(shù)的多色探針熔解曲線分析法(multicolor melting curve analysis，MMCA)MTB耐藥性檢測技術(shù)，是建立在野生型DNA分子和突變型DNA分子的GC含量不同的基礎(chǔ)之上，在PCR體系中加入兩端分別標(biāo)記有熒光基團與淬滅基團的探針，在PCR過程中擴增處于探針序列互補的單鏈核苷酸序列，在擴增完成后增加熔解曲線分析過程，同時實時監(jiān)測熒光值的變化，通過計算熒光值與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)，可獲得探針與該序列雜交產(chǎn)物的熔解曲線，并得出熔點(Tm值)，從而推得該序列突變信息[4]。該方法能夠檢測四種一線抗結(jié)核藥物及二線氟喹諾酮類(FQ)藥物，且操作簡便，報告時間3～4 h，表現(xiàn)出很高的敏感度和特異度。已發(fā)表文獻(xiàn)中多是關(guān)于該方法對利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(Lfx)耐藥性檢測與比例法藥敏試驗比對的報道，但是未見有該方法對莫西沙星(Mfx)耐藥性檢測與比例法及基因測序比對的報道，有必要對其在應(yīng)用中做進(jìn)一步的研究和驗證，從而對MDR-TB患者個體化治療提供依據(jù)。本研究對同一患者的晨痰采用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)后，采用比例法與MMCA法同時檢測5種抗結(jié)核藥物的耐藥性，對兩方法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本再采用分辨率最高、結(jié)果最為可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)——基因測序法驗證，最終評價MMCA檢測在耐藥結(jié)核病快速診斷中的臨床應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究對象

本研究為黑龍江省傳染病防治院結(jié)核病實驗室臨床標(biāo)本檢測結(jié)果的回顧性分析。以2016年1月至2016年12月于內(nèi)科住院且依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288—2008)》[5]確診、依據(jù)《WS 196—2001結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)》[6]分類的繼發(fā)性肺結(jié)核患者，且痰抗酸桿菌顯微鏡檢查和(或)MTB核酸分子檢測陽性的235例繼發(fā)性肺結(jié)核患者作為研究對象，同時將痰液(合格晨痰)MMCA檢測與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)分離株比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)進(jìn)行比對分析。235例患者中，男162例(68.94%)，女73例(31.06%)，年齡12～81歲，平均(43.6±16.5)歲。

二、主要試劑與儀器

痰抗酸桿菌顯微鏡檢查采用熒光染色顯微鏡檢查法，金胺“O”染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；分枝桿菌液體培養(yǎng)采用BACTEC MGIT 960操作系統(tǒng)，由美國BD公司提供；分枝桿菌菌種鑒定采用MTB抗原檢測試劑盒(膠體金法)，購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司；固體藥敏試驗(比例法)含藥培養(yǎng)管購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，其中Mfx濃度為2 mg/L[7]。MTBRFP、INH、EMB、FQ耐藥檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)、標(biāo)本基因測序結(jié)果、Lab-Aid 824全自動核酸提取儀、SLAN-96S全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)等由廈門致善生物科技有限公司提供。

三、試驗方法

1．痰抗酸桿菌顯微鏡檢查、分枝桿菌液體培養(yǎng)、菌種鑒定、比例法藥敏試驗遵照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[4]中的標(biāo)準(zhǔn)操作程序執(zhí)行，4項檢測方法室間質(zhì)量評價和室內(nèi)質(zhì)量控制合格。

2．MMCA方法：(1)MMCA檢測RFP、INH、EMB、FQ耐藥基因突變情況。RFP檢測區(qū)域為rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)[利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)81 bp的突變情況]；INH檢測區(qū)域為ahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8位點)以及katG315密碼子的突變情況；EMB檢測區(qū)域為embB基因306位密碼子、406位密碼子、497位密碼子的突變情況；FQ檢測區(qū)域為gyrA基因88～94位密碼子的突變情況。(2)MMCA檢測方法與結(jié)果判斷。嚴(yán)格執(zhí)行RFP、INH、EMB、FQ耐藥性檢測試劑盒說明書的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，按照Lab-Aid 824全自動核酸提取試劑盒說明書操作，在Lab-Aid 824全自動核酸提取儀上自動提取，收集模板備用。結(jié)果判定：當(dāng)標(biāo)本與陽性對照Tm值一致(誤差<1 ℃)時判定為野生型，△Tm值≥2 ℃時判定為突變型，提示該菌株對此藥物耐藥，△Tm值以儀器自動判讀為準(zhǔn)。嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行批內(nèi)質(zhì)量控制、室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評。

3．基因測序：采用雙脫氧核苷酸末端終止法(Sanger法)，測序引物RFP-F GGGAGCGGATGACCACCCA、RFP-R GCGGTACGGCGTTTCG-ATGAAC；INHKatG-F CGAGACGTTTCGGCGCATG、KatG-R CCGTCCTTGGCGGTGTATTG、InhA-17～-8-F ACATACCTGCTGCGCAATTC、InhA-17～-8-R CCGATCCCCCGGTTTCCTC、InhA94-F CGTTTCACATCGCACGGGTAG、InhA94-R CGAGATGTGGATGCCCTTGGAC、AhpC-FCTTGCCGGAAAGACATGCCCAhpC-RCTGGTGA-TAGTGGTGAAGTAGT；EmbB406/497 F CCA-GCAAACCCGCCTACT、EmbB406/497 R CATAGCGCGGTGATCAAAAAGC、EmbB306-406 F AGGCCGTTCCGGCCTGCATCGTCG、EmbB306-406 R GTGTGAGCCGGCTGTACCGCATGGACC；FQ-F GACCGCAGCCACGCCAAG、FQ-R AGCATCACCATCGCCAACG；對MMCA法與比例法藥敏試驗檢測結(jié)果不一致標(biāo)本，分別進(jìn)行基因測序法驗證比對。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

1．收集資料及方法：本研究收集MMCA法、比例法、基因測序法在痰標(biāo)本及MTB分離株中對RFP、INH、EMB、Lfx、Mfx 5種抗結(jié)核藥物耐藥性檢測結(jié)果，由雙人同時錄入Excel，并經(jīng)一致性檢查，修正錯誤錄入的數(shù)據(jù)后，建立數(shù)據(jù)庫。

2．各指標(biāo)計算方法：敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；準(zhǔn)確度=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=(a+d)/(a+b+c+d)%；陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%；約登指數(shù)=敏感度+特異度-1。

3．統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，MMCA法耐藥檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)比例法藥敏試驗進(jìn)行一致性檢驗(Kappa檢驗)，K≤0.40時,表明一致性較差；0.400.80認(rèn)為兩者一致性極好。

結(jié) 果

一、MMCA法與比例法耐藥檢測結(jié)果比較

在235例痰標(biāo)本中，以比例法藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MMCA法在RFP、INH、EMB、Lfx、Mfx 5種抗結(jié)核藥物及在MDR-TB中進(jìn)行耐藥性檢測的敏感度分別為94.64%(106/112)、88.39%(99/112)、73.08%(19/26)、92.65%(63/68)、87.50%(21/24)、84.71%(72/85)；特異度分別為93.50% (115/123)、92.68%(114/123)、 80.86% (169/209)、95.81%(160/167)、76.78% (162/211)、92.00%(138/150)；上述6種情況符合率分別為94.04%(221/235)、90.64%(213/235)、80.00%(188/235)、94.89%(223/235)、77.87%(183/235)、89.36% (210/235)；約登指數(shù)分別為0.8814、0.8107、0.5394、0.8846、0.6428、0.7670。兩種方法對RFP、INH、Lfx 3種藥物耐藥性檢測結(jié)果一致性極好(K值分別為0.88、0.81、0.88)，對MDR-TB的一致性較高(K值為0.77)，對EMB、Mfx 2種藥物耐藥性檢測結(jié)果一致性較差(K值分別為0.35、0.34)(表1)。

表1 235例晨痰標(biāo)本MMCA檢測與235例MTB分離株比例法藥敏試驗比對情況

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=a/(a+c)%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=d/(b+d)×100%；準(zhǔn)確度=(真陽性數(shù)+真陰性數(shù))/(真陽性數(shù)+真陰性數(shù)+假陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=(a+d)/(a+b+c+d)%；陽性預(yù)測值=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%=a/(a+b)×100%；陰性預(yù)測值=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陰性數(shù))×100%=d/(c+d)×100%；約登指數(shù)=敏感度+特異度-1

二、MMCA法與比例法檢測結(jié)果不一致標(biāo)本的MMCA法與基因測序結(jié)果比較

兩種方法對5種抗結(jié)核藥物檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本共計147例，分別進(jìn)行MMCA法和基因測序法檢測結(jié)果的比對。在痰液標(biāo)本中MMCA法與基因測序法檢測結(jié)果不一致標(biāo)本15例，符合率達(dá)89.80%(132/147)；在培養(yǎng)后MTB分離株標(biāo)本中，MMCA法與基因測序法檢測結(jié)果不一致標(biāo)本僅有2例，符合率達(dá)98.64%(145/147)。在MMCA法與比例法藥敏試驗符合率不理想的EMB和Mfx兩種藥物中，MMCA檢測結(jié)果與基因測序法的結(jié)果符合率，在痰標(biāo)本檢測中分別為93.62%、96.00%；分離株標(biāo)本中分別為97.89%、98.00%(表2，3)。

表2 147例比例法藥敏試驗與MMCA法檢測結(jié)果不一致標(biāo)本進(jìn)行MMCA法與基因測序結(jié)果比較

表3 5種藥物147例比例法藥敏試驗與MMCA檢測結(jié)果不一致分布情況

注a：在比例法藥敏試驗檢測為耐藥而MMCA檢測為敏感的7份標(biāo)本中，有1份經(jīng)基因測序結(jié)果顯示為耐藥；b：在比例法藥敏試驗檢測為耐藥而MMCA檢測為敏感的3份標(biāo)本中，有1份經(jīng)基因測序結(jié)果顯示為異質(zhì)性耐藥

討 論

MTB產(chǎn)生耐藥性的主要機制是基因突變。關(guān)鍵基因位點的突變會導(dǎo)致MTB耐藥性的產(chǎn)生，如rpoB、katG、embB、gyrA基因一些位點突變分別與RFP、INH、EMB、FQ類藥物耐藥性的產(chǎn)生相關(guān)[4]。當(dāng)這些基因突變在耐藥株中占有較大比率時，則可以用分子生物學(xué)的方法通過檢測基因突變來判斷MTB對藥物的耐藥性，這類檢測稱為分子耐藥性檢測。但分子耐藥性檢測與表型藥敏試驗并非完全一致，分子耐藥性檢測的準(zhǔn)確性由耐藥基因突變及耐藥性的關(guān)聯(lián)程度決定[8]。目前，基于MTB突變基因位點檢測有多種方法，如測序法(其他鑒定技術(shù)的參考標(biāo)準(zhǔn))、線性探針法、MMCA法以及基因芯片技術(shù)等，本研究通過對235例痰標(biāo)本MMCA法與比例法藥敏試驗比對評價其臨床應(yīng)用效能。

MMCA法對RFP、INH、Lfx、MDR-TB耐藥性檢測的敏感度分別為94.64% (106/112)、88.39%(99/112)、92.65%(63/68)、84.71%(72/85), 特異度分別為93.50% (115/123)、92.68(114/123)、95.81%(160/167)、92.00% (138/150)，Kappa檢驗K值分別為0.88、0.81、0.88、0.77，顯示MMCA法與金標(biāo)準(zhǔn)比例法藥敏試驗具有極好的一致性，與文獻(xiàn)[9-10，11-14]報道相符；對EMB耐藥性檢測的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度分別為73.08%(19/26)、80.86%(169/209)、80.00%(188/235)，與嚴(yán)虹等[15]報道相似，Mfx未見報道。

5種藥物2種方法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本共計147份，經(jīng)基因測序技術(shù)驗證，痰液及培養(yǎng)分離株2種標(biāo)本進(jìn)行MMCA檢測結(jié)果與基因測序結(jié)果的總符合率分別為89.80%、98.64%；MMCA與比例法藥敏試驗檢測結(jié)果符合率不理想的對EMB、Mfx的耐藥性檢測也同樣是MMCA和基因測序結(jié)果的符合率高(表2)，在痰標(biāo)本中分別為93.62%、96.00%；分離株標(biāo)本中分別為97.89%、98.00%。

日常工作中痰液標(biāo)本的MMCA與比例法藥敏試驗檢測結(jié)果不一致的原因：首先，MTB表型藥敏試驗作為金標(biāo)準(zhǔn)，但也有其方法學(xué)局限性。對RFP和INH的藥敏試驗結(jié)果具有較高的可靠性和臨床價值，而EMB則較差[16]。而分子耐藥性檢測方法是基于MTB的基因位點突變來判斷對RFP是否耐藥，當(dāng)耐藥臨界點濃度為40 mg/L時區(qū)分能力為85.8%，有14.2%的菌株被誤判為敏感株或耐藥株[16]；正如WHO 2014年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南手冊》[17]所述：MTB對RFP耐藥定義為表型或基因型藥敏試驗發(fā)現(xiàn)RFP耐藥，一旦分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)RFP耐藥基因突變，無論表型藥敏試驗結(jié)果如何，需要考慮為耐藥結(jié)核病的可能。

INH耐藥臨界點濃度為0.2 mg/L(能最大程度地區(qū)分敏感株和耐藥株)時區(qū)分能力為75.8%,有11.1%的耐藥株誤判為敏感株、13.1%的敏感株誤判為耐藥株[16]；而MMCA檢測的基因位點是目前覆蓋耐藥位點最多的檢測方法，但MTB耐INH的機制比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。

EMB耐藥臨界點濃度為2 mg/L，表型藥敏試驗不能有效區(qū)分耐藥菌株或敏感菌株，其誤判率更高[16]；因此，EMB 在MMCA檢測結(jié)果與比例法藥敏試驗結(jié)果的比對分析中，比例法已失去其金標(biāo)準(zhǔn)的價值，導(dǎo)致MMCA陽性預(yù)測值為32.2%、Kappa檢驗K值為0.35；2種方法檢測結(jié)果不一致的47例進(jìn)行基因測序，痰液和分離株標(biāo)本采用MMCA與基因測序結(jié)果的符合率分別為93.62%(44/47)、97.87%(46/47)，優(yōu)于表型藥敏試驗?；驕y序中發(fā)現(xiàn)2例試劑盒檢測位點范圍之外突變，分別為454GCG>GTG、504GCC>ACC，目前未見文獻(xiàn)報道該突變是否會引起對EMB耐藥，但是本研究中該2例采用比例法藥敏試驗結(jié)果均為耐藥，與基因測序一致。表3數(shù)據(jù)顯示，分子藥敏試驗對耐藥的發(fā)現(xiàn)率為76.87%(113/147)、表型藥敏試驗對耐藥的發(fā)現(xiàn)率為23.13%(34/147)，說明隨著分子診斷技術(shù)的應(yīng)用推廣，勢必大幅度提高耐藥結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)率。

FQ類藥物主要作用于MTB的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，具有類似的耐藥機制，有明顯的交叉耐藥現(xiàn)象，但對第二、三代FQ類藥物耐藥的菌株可能對第四代FQ類藥物敏感，而且與該類藥物作用時間和頻度密切相關(guān)[18]。本研究中，對Lfx、Mfx檢測的敏感度和特異度分別為92.65% (63/68)、95.81% (160/167)，87.50% (21/24)、76.78% (162/211)；Kappa值分別為0.88、0.35；陽性預(yù)測值分別為90.00% (63/70)、30.00% (21/70)；提示Lfx在2種方法中一致性極好，與李國利等[12]報道一致；在對Mfx的檢測中一致性較差，其比例法與MMCA比對未見報道。文獻(xiàn)報道，鑒于FQ類藥物中不同藥物的耐藥性差異很大，建議應(yīng)開展FQ類藥物的藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果選藥[16]。上述差異，筆者認(rèn)為主要是由于先前界定的Mfx耐藥臨界點濃度為2 mg/L[7]，而2018年 WHO新修訂的標(biāo)準(zhǔn)為1 mg/L[19],會將比例法一部分原本耐藥的菌株判為敏感。本研究中，比例法藥敏試驗結(jié)果敏感而MMCA檢測結(jié)果耐藥的有49例，占2種方法不一致的94.23%(49/52)也充分顯示了存在上述問題；另外也存在本院結(jié)核病患者大部分來自于農(nóng)村，以往使用Lfx者比較普遍，而Mfx的使用頻數(shù)低，從而2種藥物的耐藥率差異較大。因此，加強對FQ類藥物臨床使用的管理，以有效減少此類藥物耐藥性的產(chǎn)生[18]。再有應(yīng)該對FQ類藥物分子水平耐藥機制及耐藥位點做深入研究，旨在發(fā)現(xiàn)FQ類藥物中不同品種藥物耐藥機制的差異，對臨床個體用藥將具有重要的指導(dǎo)價值。

MDR-TB中，通過MMAC法檢測為MDR-TB而比例法藥敏試驗未檢出的12例中，MMAC法與基因測序結(jié)果全部一致，其敏感度為84.71%(72/85)，與Pang 等[13]的報道相似；但特異度為92.00% (138/150)，優(yōu)于Pang 等[13]的報道。

另外，還有以下幾種原因?qū)е绿禈?biāo)本的MMCA檢測結(jié)果與比例法藥敏試驗不一致：(1)當(dāng)痰標(biāo)本中MTB量低于MMCA檢測下限時，使個別痰液標(biāo)本表型藥敏試驗為耐藥而分子耐藥性檢測為敏感，與測序結(jié)果不一致,表2中RFP和INH分別有2例EMB有1例為此種情況，這類患者在評價臨床療效不理想時，一定密切關(guān)注后續(xù)的表型藥敏試驗結(jié)果，實時調(diào)整個體化治療方案。因此，臨床工作中發(fā)揮分子耐藥性檢測早期快速篩查的優(yōu)勢，待表型藥敏試驗報告結(jié)果后，結(jié)合臨床療效綜合分析，及時調(diào)整優(yōu)化方案。(2)柳清云等[20]所述異質(zhì)性耐藥,是指在同一標(biāo)本中同時存在耐藥菌和敏感菌的現(xiàn)象,這體現(xiàn)了細(xì)菌群體從部分耐藥向完全耐藥轉(zhuǎn)變的過程；本研究在147例中有9例，占6.12%(9/147)經(jīng)測序和(或)MMCA檢測證實為異質(zhì)性性耐藥。高旭等[21]報道，異質(zhì)性耐藥是導(dǎo)致表型和基因型耐藥性檢測結(jié)果不符的重要原因，為排除異質(zhì)性耐藥對耐藥基因檢測的影響,提高基因型與表型耐藥性檢測結(jié)果的一致性,需要開發(fā)應(yīng)用更敏感的基因型耐藥檢測技術(shù),以提高耐藥結(jié)核病快速檢測水平，除基因測序外MMCA是目前惟一可以檢測異質(zhì)性耐藥的的新技術(shù)。 (3)在對RFP的耐藥性檢測中，痰液標(biāo)本MMCA檢測結(jié)果與基因測序不一致者有4例，其中2例為MMCA檢測中△Tm值分別為1.3 ℃和1.7 ℃，按MMCA說明書△Tm>2.0 ℃判定標(biāo)準(zhǔn)判為敏感，而測序結(jié)果分別為516 GAC→GGC、531TCG→TTG突變，目前MMCA自動判讀軟件已升級，有效避免了此類突變的漏報，操作者也應(yīng)在△Tm值在1.5 ℃左右時，仔細(xì)分析曲線，必要時做該標(biāo)本的基因測序，以驗證MMCA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。(4)盡管筆者收集了痰抗酸桿菌顯微鏡檢查和(或)MTB核酸分子檢測陽性患者的合格晨痰，即便如此，由于DNA提取過程中的損耗，以及標(biāo)本擴增的效率等問題[6]，仍然會有個別標(biāo)本出現(xiàn)未知的擴增抑制而使2種方法的檢測結(jié)果不一致。(5)本研究對RFP進(jìn)行比例法藥敏試驗?zāi)退幎鳰MCA耐藥性檢測敏感的6例中，有2例△Tm值分別為1.3 ℃和1.7 ℃而報告為敏感；4例為MMCA法檢測結(jié)果與基因測序一致，該患者為MDR-TB患者，可能存在MTB細(xì)胞壁增厚、產(chǎn)生藥物外排泵、產(chǎn)生藥物水解酶等其他耐藥機制引起的耐藥。

本研究痰液、分離株MMCA與測序方法比對平均符合率分別為89.80%(132/147)、98.64%(145/147)，二者有一定差異，與某些痰液原始標(biāo)本載量低于MMCA檢測下限時易出現(xiàn)漏檢有關(guān)，文中有8例痰液[3.4%(8/235)]MMCA與基因測序結(jié)果不一致；而當(dāng)標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)富集后，MMCA與測序法一致性很好；極少數(shù)痰液受諸如食物殘渣等雜質(zhì)或者未知成分的影響，使DNA提取過程損耗，以及出現(xiàn)標(biāo)本擴增的效率、擴增抑制等問題[4]；北方干燥季節(jié)及由某種病原體感染引起的重度黏稠的痰液不易液化會引起漏檢耐藥結(jié)核病；異質(zhì)性耐藥也是其中一個影響因素。但盡管如此，也要遵循WHO及《十三五全國結(jié)核病防治規(guī)劃》中要求的快速篩查耐藥結(jié)核病，采用痰液直接進(jìn)行分子藥敏檢測，快速診治MDR-TB，后續(xù)再結(jié)合臨床療效及比例法藥敏試驗結(jié)果綜合評價，調(diào)整患者個體化治療方案。

綜上所述，痰液MMCA法直接檢測患者M(jìn)TB耐藥情況,與金標(biāo)準(zhǔn)比例法藥敏試驗及參考方法基因測序技術(shù)一致性好，速度快，敏感度高、可重復(fù)性好，以及結(jié)果易判讀[22]、覆蓋耐藥位點多、閉管式操作可大大降低PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險等特點，顯示其對耐藥MTB的快速檢測是有效、可行的，在結(jié)核病特別是耐藥結(jié)核病早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)、控制傳播、保護易感人群方面將發(fā)揮重要作用。

志謝深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心房宏霞老師對本研究統(tǒng)計學(xué)方面給予了大力支持和幫助！